Untersuchung des durch Kupfer-Nanopartikel induzierten programmierten Zelltods in Bakterien

In dieser Studie wird die bakterizide Wirksamkeit von Kupfer-Nanoparten gegen drei häufige klinisch bedeutsame Bakterien untersucht. Es untersucht Fälle wie die Erzeugung von ROS und eine mögliche Beteiligung des programmierten Zelltods.

Eine aktuelle Herausforderung besteht darin, konsistente Koloniezahlen zu erreichen. Ich glaube, das ist auf eine Intervention zurückzuführen. Die Zellmodernisierung während der Verdünnung führt zu einer gefälschten Zählung mit der Lokalisation im Vergleich zu erfahreneren Zählen.

Unsere Gruppe war die erste, die einen Zellmodulator verwendete, um bakterizide Mechanismen von Kupfer-Nanopartikeln zu untersuchen, und zeigte, dass der bakterielle Tod zelluläre Prozesse wie ROS-Erzeugung und Autophagie beinhaltet.

Das Protokoll befasst sich mit der Notwendigkeit eines tieferen Verständnisses des Mechanismus, durch den Kupfer-Nanopartikel Bakterien abtöten, und konzentriert sich insbesondere auf den wenig erforschten Bereich der bakteriell programmierten Zelltodwege.

Unter Verwendung verschiedener Zellmodulatoren haben wir bestätigt, dass der durch Kupfernanopartikel induzierte bakterielle Tod Autophagie und ROS-Überlastung beinhaltet, und Schlüsselwege identifiziert, die durch zuverlässige dreifache Experimente mit einem einfachen Design unterstützt werden

[Erzähler] Um zunächst kommerzielle Kupfer-Nanopulver mit Durchmessern von 25 Nanometern und 60 bis 80 Nanometern von einem kommerziellen Lieferanten zu erhalten. Verwenden Sie einen Milliliter eines millimolaren SDS als Dispergiermittel für jede Nanopartikelgröße. Anschließend dispergieren Sie die Nanopartikel mit einem Ultraschallbad für mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur. Besorgen Sie sich als Nächstes die Stämme Escherichia coli, Acinetobacter baumannii und Staphylococcus aureus von den jeweiligen biologischen Ressourcenzentren. Kultivieren Sie jedes Bakterium in 10 Millilitern LB-Brühe unter aeroben Bedingungen bei 37 Grad Celsius. Verdünnen Sie Bakterienkulturen in LB-Medium, um eine optische Dichte von etwa 0,5 bei 600 Nanometern zu erreichen. Verwenden Sie nun Stamm-Kupfer-Nanopartikellösungen, um einen Bereich von Konzentrationen zwischen null und 100 Mikrogramm pro Milliliter beider Größen herzustellen. Pipettieren Sie 500 Mikroliter der Bakterienkulturen in Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 3.300 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Pipettieren des Überstands geben Sie unterschiedliche Konzentrationen beider Größen der Nanopartikel in jedes Röhrchen. Kontrollgruppen mit 500 Mikrolitern PBS als Negativkontrolle und 500 Mikrolitern 70%igem Alkohol als Positivkontrolle behandeln. Anschließend werden alle Proben unter Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute bei 37 Grad Celsius 24 Stunden lang inkubiert. Waschen Sie die Bakterien nach der Inkubation mit PBS und verteilen Sie sie auf LB-Agarplatten. Inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Zählen Sie am nächsten Tag die Kolonien auf jeder Platte für alle Behandlungsgruppen. Behandeln Sie Bakterien zwei Stunden lang mit fünf mikromolaren SBI, eine Stunde lang mit 0,5 mikromolaren Necrosulfonamid, 30 Minuten lang mit 100 nanomolaren Wortmannin oder 30 Minuten mit 100 nanomolaren Z-VAD. Nachdem die gesamte Vorbehandlung abgeschlossen ist, zentrifugieren Sie alle Röhrchen 10 Minuten lang bei 3.300 g. Dann resuspendieren Sie das Pellet in 800 Mikrolitern PBS, um den Modulator vor der Behandlung zu waschen. Verteilen Sie die resuspendierten Pellets. Zentrifugieren Sie jedes Röhrchen und entsorgen Sie dann den Überstand. Die Pellets werden vor der Inkubation unter Rühren in Nanopartikel-Modulatormischungen resuspendiert. Fügen Sie nun 70% Ethanol und PBS als Positiv- und Negativkontrollen hinzu. Schließen Sie leere Kontrollgruppen ein, die mit Inhibitoren, aber ohne Nanopartikel behandelt wurden. Nach der Inkubation pipettieren Sie das Reagenz für die Zellviabilität in einem Volumenverhältnis von eins zu zehn und inkubieren. Nachdem Sie die Kulturen erneut zentrifugiert haben, übertragen Sie die Überstände auf 96-Well-Platten. Messen Sie die Fluoreszenz bei 560 Nanometern Anregung und 590 Nanometern Emission mit einem Mikroplatten-Reader. Die restlichen Überstände werden auf 10 hoch minus fünf und 10 hoch minus vier verdünnt und auf LB-Agarplatten zur Kultur verteilt. Zählen Sie die einzelnen Völker am nächsten Tag. Pipettieren Sie Bakterienkulturen in Mikrozentrifugenröhrchen. Setzen Sie die Kulturen dann drei Stunden lang 405 Nanometern ultraviolettem Licht aus. Inkubieren Sie die Kulturen anschließend zwei Stunden lang bei 45 Grad Celsius. Dann inkubieren Sie die Bakterien zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius. Nach der Kältebehandlung inkubieren Sie die Bakterien 30 Minuten lang in 3% Wasserstoffperoxid. Halten Sie eine Kontrollgruppe bei 37 Grad Celsius in LB-Brühe. Behandeln Sie nun Bakterien 24 Stunden lang mit 20- oder 60-Nanometer-Partikeln in Konzentrationen zwischen einem und 100 Mikrogramm pro Milliliter. Waschen Sie dann die behandelten Bakterien zweimal mit PBS. Nach der Zentrifugation werden die Bakterienpellets in einer fünfmikromolaren Lösung von 2',7' Dichlordihydrofluoresceindiacetat-Farbstoff resuspendiert. Analysieren Sie die Fluoreszenzintensität bei 520 oder 530 Nanometer Emission. Die Koloniezahlen von Escherichia coli wurden signifikant um 20 Nanometer Kupfer-Nanopartikel bei einem Mikrogramm pro Milliliter und um 60 Nanometer Kupfer-Nanopartikel bei fünf Mikrogramm pro Milliliter reduziert. Staphylococcus aureus zeigte eine signifikante Verringerung der Koloniezahlen bei allen Konzentrationen beider Nanopartikelgrößen. In Acinetobacter baumannii erforderte die Verringerung der Koloniezahl fünf Mikrogramm pro Milliliter 20-Nanometer-Kupfer-Nanopartikel und 10 Mikrogramm pro Milliliter 60-Nanometer-Kupfer-Nanopartikel. Kupfer-Nanopartikel-Behandlungen induzierten die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies in allen Bakterien, wobei 20-Nanometer-Partikel bei niedrigeren Konzentrationen die höchsten Anteile positiver Zellen zeigten. Im Gegensatz dazu führten Behandlungen mit 60-Nanometer-Kupfer-Nanopartikeln zu einer konsistenten Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies über alle Konzentrationen hinweg. Der programmierte Zelltodmodulator Z-VAD erhöhte das Überleben von Escherichia coli, die mit beiden Nanopartikelgrößen in niedrigen bis moderaten Konzentrationen behandelt wurden. Die NSA-Behandlung verbesserte das Überleben von Staphylococcus aureus über alle 20-Nanometer-Kupfernanopartikelkonzentrationen hinweg. Acinetobacter baumannii zeigte eine verbesserte Viabilität mit Z-VAD unter einem, fünf und 10 Mikrogramm pro Milliliter sowohl 20 als auch 60 Nanometer Kupferpartikel-Exposition, während NSA die Viabilität bei nur 10 Mikrogramm pro Milliliter 20-Nanometer-Kupfer-Nanopartikel-Exposition erhöhte.