Oropharyngeale Verabreichung von Bleomycin im Mausmodell der Lungenfibrose

Unsere Forschung zielt darauf ab, die Immunmechanismen zu verstehen, die der Pathogenese der Lungenfibrose zugrunde liegen. Eine der größten Herausforderungen auf diesem Gebiet ist nach wie vor die Übertragung von In-vitro- und In-vivo-Modellen auf die humane Lungenfibrose. Es gibt eine Reihe von Tiermodellen, um die Lungenfibrose zu untersuchen.

Wir versuchen, eines der am häufigsten verwendeten Modelle, das Bleomycin-Mausmodell, so zu standardisieren, dass es leicht für andere Labore angepasst werden kann. Wir stellen eine minimalinvasive, hochreproduzierbare und sichere Methode zur Verabreichung von Bleomycin im Mausmodell der Lungenfibrose vor. Dieses Tiermodell ergänzt in vitro in Humanstudien.

Dabei werden die Zelltypen gesteuert, die für die Pathogenese entscheidend sind, und physiologisch Veränderungen der Ventilation, der Perfusion und des Gasaustauschs repliziert, die während einer Verletzung auftreten. Wir gehen davon aus, dass Interventionen, die den histopathologischen Schweregrad in vivo stark reduzieren, auf bessere klinische Ergebnisse hinweisen können. Fahren Sie mit der Zubereitung von Bleomycin-Lösungen in einer chemischen Haube fort, während Sie die richtigen chemotherapeutischen Vorsichtsmaßnahmen befolgen.

Lösen Sie zunächst Bleomycin-Pulver in sterilem PBS auf, um eine Stammkonzentration von 10 Einheiten pro Milliliter herzustellen. Abhängig von dem spezifisch verwendeten Bleomycin und dem Versuchsziel ist die endgültige Arbeitskonzentration entsprechend der erforderlichen Dosis auf der Grundlage des Körpergewichts vorzubereiten. Um das endgültige Verabreichungsvolumen anzupassen, verdünnen Sie Bleomycin auf 0,375 Einheiten pro Milliliter, um ein Gesamtvolumen von 50 Millilitern für eine 25-Gramm-Maus zu gewährleisten.

Hängen Sie die ordnungsgemäß betäubte Maus in einem Winkel von 60 bis 80 Grad an die Eingriffsplattform, indem Sie sie an den vorderen Schneidezähnen aufhängen, um den Oropharynx effektiv zu öffnen. Verschließen Sie den Nasengang mit einer glatten mikrovaskulären Klemme, um die Atmung durch den Oropharynx zu erzwingen. Ziehen Sie die Zunge mit einer Pinzette aus dem Oropharynx zurück.

Geben Sie mit einer Stepper-Pipette mit einer Stummelköder-Stummelspitze vorsichtig die gewünschte Menge Bleomycin oder Kochsalzlösung in den hinteren Teil des Oropharynx. Stellen Sie sicher, dass eine sichtbare Flüssigkeitsblase grob sichtbar ist. Halten Sie die Zunge so lange fest, bis die Maus die Lösung aspiriert, was sichtbar und oft hörbar ist.

Sobald die Aspiration bestätigt ist, entfernen Sie vorsichtig den Nasenclip. Beobachten Sie die Maus 15 Sekunden lang in hängender Position, um sicherzustellen, dass die Bleomycin-Lösung nicht zurückfließt, bevor Sie sie in ihren Käfig zurückbringen. Legen Sie das Tier dann auf die Seite in seinen Käfig mit einem Heizkissen darunter, um die Wärmeneutralität zu wahren.

Kneifen Sie die Zehen vorsichtig zusammen und stellen Sie sicher, dass die Tiere euthermisch bleiben, um das Aufwachen zu erleichtern. Überwachen Sie die Mäuse, bis sie wieder bei vollem Bewusstsein sind, was in der Regel ein bis zwei Stunden dauert, abhängig von der Ketamindosis, der Größe und dem Stoffwechsel des Tieres. Überwachen Sie die Mäuse täglich klinisch auf Veränderungen des Körpergewichts, der Fellpflege, des Aktivitätsniveaus und des Atmungsstatus.

Verfolgen Sie das Gewicht als wichtigen Indikator für die Effektivität des Modells. Entnehmen Sie zu gegebener Zeit die Lungen der ordnungsgemäß eingeschläferten Mäuse. Für die Histologie präparieren Sie die Lunge auf dem Block und fixieren Sie sie 24 Stunden lang in 4% Paraformaldehyd.

Fahren Sie mit dem Einbetten, Trennen und Färben von Paraffin mit Hämatoxylin und Eosin oder Massons Trichrom fort. Für die Messung von löslichem Kollagen homogenisieren Sie die rechte Lunge. Für die Durchflusszytometrie wird die rechte Lunge mit einem Gewebedissoziator und einer enzymatischen Lösung verdaut, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.

Führen Sie durchflusszytometrische Färbungen und Analysen nach Standardprotokollen durch. Im Vergleich zur PBS-Kontrolle wurden fibrotische Veränderungen in den Alveolarsepten und kleinen entzündlichen oder fibrotischen Bereichen in mit Bleomycin behandelten Lungenproben bis zum siebten Tag beobachtet. Am Tag 14 traten größere und konfluentere fibrotische Regionen auf, die die normale Alveolararchitektur signifikant zerstörten.

Am 21. Tag blieben die fibrotischen Veränderungen mit keinem signifikanten Anstieg mehr bestehen. Das modifizierte Ashcroft-Scoring-System bestätigte, dass die Fibrosewerte zwischen Tag 14 und 21 ähnlich waren. Hydroxyprolin-Assays, die an Tag 14 durchgeführt wurden, zeigten einen Anstieg des Gesamtgehalts an löslichem Kollagen in mit Bleomycin behandelten Lungen im Vergleich zur Kontrollgruppe.

Die quantitative Polymerase-Kettenreaktionsanalyse zeigte eine Hochregulation der profibrotischen Gene Col1A1 und TGFB als Reaktion auf Bleomycin. Die durchflusszytometrische Analyse ergab eine robuste Infiltration myeloischer Zellen, einschließlich interstitieller Makrophagen, von Monozyten abgeleiteter Alveolarmakrophagen und Neutrophilen, in der Lunge.