Schnelle Depletion von Nierenmakrophagen mit humanem CD59/Intermedilysin-Zellablationswerkzeug

Wir verwenden die Intermedilysin-vermittelte Oblation der humanen CD59-exprimierenden Zelle in Mäusen, um die Regeneration von Nierenmikrophagen zu untersuchen, wobei wir uns auf die Chemokin-getriebene Monozyten-Recoupment und die Nischenetablierung der Immunüberwachung nach Verletzungen konzentrieren. Jüngste Entwicklungen auf unserem Gebiet zeigen den Mechanismus der Regeneration von Nierenmakrophagen und heben ein spezifisches Chemokin hervor, das Makrophagen rekrutiert, und wie die Immunüberwachung nach akutem Nierenversagen wiederhergestellt wird. Wir kombinieren Tamoxifen-induzierbare Kryogenetik, Intermedilysin-Ablation, Multiparameter-Durchflusszytometrie und Intravitalmikroskopie, um Nierenmakrophagen in Echtzeit abzutragen, zu verfolgen und zu visualisieren.

Zu den wichtigsten Herausforderungen gehören die Vermeidung systemischer Entzündungen, die ausschließliche Ausrichtung auf residente Makrophagen und die Messung einer schnellen Regeneration, ohne die empfindliche Nierenumgebung zu stören. Wir zeigten, dass Monozyten 88% der Nierenmakrophagen innerhalb von sieben Tagen nach der Ablation wiederherstellen, ein Prozess, der entscheidend von der Signalachse CX3 CR1 und CX3 CL1 abhängt. Zu Beginn Maisöl auf 42 Grad Celsius vorheizen.

Lösen Sie 100 Milligramm Tamoxifen in fünf Millilitern vorgewärmtem Maisöl auf, um eine Stammlösung mit einer Konzentration von 20 Milligramm pro Milliliter herzustellen. Verabreichen Sie Tamoxifen intraperitoneal an 10 bis 12 Wochen alte männliche Mäuse in einer Dosis von 100 Mikrogramm pro Gramm Körpergewicht. Nach 15 Tagen injizieren Sie den Mäusen eine intravenöse Einzeldosis Intermedilysin in einer Dosis von 120 Nanogramm pro Gramm Körpergewicht.

Überwachen und bestätigen Sie die residente Makrophagenablation und die anschließende Regeneration durch Durchflusszytometrie nach einem, drei und sieben Tagen nach der Verabreichung von Intermedilysin. Verwenden Sie für die Nierenentnahme eine feine Pinzette und eine Schere, um einen horizontalen Schnitt in der unteren Bauchregion einer euthanasierten Maus zu machen. Verlängern Sie den Schnitt vertikal entlang der Mittellinie bis knapp unter den Brustkorb oder das Brustbein.

Ziehen Sie die Haut und den Muskel sanft zurück, um die Brusthöhle freizulegen. Schneiden Sie den rechten Vorhof auf, damit das Blut aus dem Kreislauf abfließen kann. Führen Sie eine 21- bis 23-Gauge-Nadel in den linken Ventrikel ein.

Beginnen Sie die Durchblutung mit 10 bis 20 Millilitern kaltem PBS, um das Blut auszuspülen. Setzen Sie die Perfusion fort, bis die Nieren blass erscheinen, was auf eine effektive Blutreinigung hinweist. Positionieren Sie die Nieren an der dorsalen Körperwand und trennen Sie sie vorsichtig mit Pinzette und Schere vom umgebenden Gewebe.

Schneiden Sie die Nierenkapseln heraus und legen Sie die Nieren sofort in kaltes PBS, um einen Abbau zu verhindern. Bereiten Sie 100 Milliliter Verdauungsenzymcocktail vor, indem Sie calcium- und magnesiumfreies HBSS, Kollagenase IV und DNase I mischen. Bereiten Sie die Enzymlösung frisch vor und bewahren Sie sie bis zur Verwendung auf Eis auf. Zerkleinern Sie die Nieren mit einer sterilen Schere in einer Petrischale, die fünf Milliliter HBSS enthält, in winzige Fragmente.

Das zerkleinerte Nierengewebe wird in 15-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern der vorbereiteten Enzymlösung überführt. Inkubieren Sie nun die Röhrchen bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten unter leichtem Rühren, um das Gewebe zu dissoziieren. Zerreiben Sie das Gewebe vorsichtig mit einer Pipette oder einem Spritzenkolben, um die Zellklumpen weiter aufzubrechen.

Entfernen Sie Ablagerungen, indem Sie die Zellsuspension durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb leiten. Die Zellsuspension wird bei 700 g 10 Minuten lang bei 18 Grad Celsius zentrifugiert. Dekantieren Sie anschließend den Puffer vorsichtig.

Resuspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern Lysepuffer, bevor Sie es fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren, um die roten Blutkörperchen zu lysieren. Fügen Sie PBS hinzu, um die Zellen zu waschen und den Lysepuffer zu entfernen. Bewahren Sie die resultierende einzellige Suspension bis zur weiteren Verwendung auf Eis auf.

Für die Dichtegradientenzentrifugation resuspendieren Sie das Zellpellet zunächst in 10 Millilitern einer Lösung mit einem Dichtegradienten von 30 %. Schichten Sie dies vorsichtig über drei Milliliter einer Gradientenlösung mit 70 % Dichte in ein Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie den Gradienten 30 Minuten lang bei 500 g, ohne eine Pause einzulegen.

Nach der Zentrifugation die Grenzschicht zwischen der 30%- und der 70%-Lösung vorsichtig auffangen. Waschen Sie die gesammelten Zellen zweimal mit 10 Millilitern PBS und zentrifugieren Sie jede Wäsche bei 500 g für 10 Minuten. Resuspendieren Sie das endgültige Zellpellet in einem Milliliter FACS-Puffer in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer unter einem Hellfeldmikroskop und stellen Sie die Zellkonzentration auf zwei mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter ein. Pelletieren Sie die Zellen in 1,5-Milliliter-Röhrchen, indem Sie sie fünf Minuten lang bei 650 g zentrifugieren, und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter FACS-Puffer. Anti-CD 16- oder 32-Antikörper in einer Verdünnung von eins bis 200 hinzufügen, um die unspezifische Bindung des FC-Rezeptors zu blockieren.

Nachdem Sie die Zellen 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubiert haben, färben Sie die Zellen mit Aqua Lebend-/Totfarbstoff und einem vorkonjugierten Antikörpercocktail, einschließlich CD45 E 450, CD11 B PE SI7, HCD59 PE und F4/80 BV 605. Geben Sie den Antikörpercocktail direkt in die Zellsuspension. Inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln, um die Fluorophore zu schützen.

Waschen Sie dann die Zellen zweimal mit FACS-Puffer. Fixieren Sie die Zellen 30 Minuten lang in 1% Paraformaldehyd auf Eis. Waschen Sie die Zellen dann zweimal mit FACS-Puffer, um restliches Fixiermittel zu entfernen.

Erfassen Sie gefärbte und fixierte Zellen mit einem Durchflusszytometer. Analysieren Sie die Daten mit der Software. Identifizieren Sie nieren- und andere geweberesidente Makrophagen und Mikroglia mit den Markern CD45, CD11B und F4/80.

Führen Sie ein anfängliches Gating durch, um lebende Zellen mithilfe von Vorwärts- und Seitenstreuprofilen auszuwählen. Eliminieren Sie Dubletten mit dem Vorwärtsstreubereich im Vergleich zum Höhenring. Schließen Sie tote Zellen mit dem Viabilitätsfarbstoff aus.

Anreicherung von Immunzellen durch Gating auf CD45-positive Populationen. Definieren Sie nierenresidente Makrophagen als CD11b+F4/80hi-Zellen innerhalb des CD45-positiven Gates, wie in der Gating-Strategie gezeigt. Definieren Sie Mikroglia-Populationen als CD11b+CD45-Zwischenzellen und führen Sie die abschließende Analyse durch.

Eine einzelne prominente Proteinbande wurde in der Nähe von 54 Kilodalton im SDS-Seitengel beobachtet, was die Reinheit und das erwartete Molekulargewicht von rekombinantem Intermedilysin bestätigt. Gereinigtes Intermedilysin zeigte dosisabhängig eine starke hämolytische Aktivität und erreichte eine Lyse der roten Blutkörperchen von 50 % bei 7,24 Nanogramm pro Milliliter und eine nahezu vollständige Lyse von 650 Nanogramm pro Milliliter. Die durchflusszytometrische Analyse bestätigte eine erfolgreiche und selektive Depletion von Nierenmakrophagen in induzierbaren humanen CD59-Compound-Cre-R-Mäusen einen Tag nach der Verabreichung von Intermedilysin, ohne Depletion bei Kontrollmäusen.

Die Nierenmakrophagen begannen sich am dritten Tag wieder zu besiedeln und erholten sich bis zum siebten Tag auf etwa 88 % ihrer ursprünglichen Population. Nur 5 % der neu regenerierten Nierenmakrophagen exprimierten am siebten Tag humanes CD59, was darauf hindeutet, dass die Wiederbesiedlung in erster Linie über die Rekrutierung von Monozyten und nicht über die In-situ-Proliferation erfolgte.