Ein In-vitro-Blasenmodell für katheterassoziierte Harnwegsinfektionen

- Unsere Forschung konzentriert sich auf katheterassoziierte Harnwegsinfektionen. Wir verwenden In-vitro-Modelle wie das Blasenmodell, um die Erreger, die CAUTIs verursachen, besser zu verstehen.

Das In-vitro-Blasenmodell bietet eine kontrollierte Umgebung, um die praktische Anwendung von diagnostischen Instrumenten und therapeutischen Interventionen für den Einsatz in der CAUTI-Behandlung zu testen.

Die katheterisierten Harnwege sind eine komplexe Umweltnische mit wichtigen Parametern wie der Katheteroberfläche und dem Ernährungsmilieu des Urins, die eine In-vitro-Replikation erschweren.

Ein Hauptziel unserer Forschung ist es, Wege zu finden, die Biofilmbildung auf medizinischen Geräten wie Harnkathetern zu kontrollieren, um die Ergebnisse für Patienten zu verbessern. Wir nutzen unsere Modelle auch, um die Entwicklung von Antibiotikaresistenzen in Bakteriengemeinschaften zu untersuchen und Fragen darüber zu beantworten, wie diese entstehen und was wir tun können, um sie zu verhindern.

[Erzähler] Führen Sie zunächst einen Foley-Katheter in die zentrale Glaskammer des In-vitro-Blasenmodells ein und befestigen Sie den Katheter nach dem Aufblasen des Ballons mit der mitgelieferten Spritze mit sterilem Wasser. Befestigen Sie dann den Abfallbeutel am Katheteranschluss, bevor Sie das In-vitro-Blasenmodellgerät an das AUM-Reservoir anschließen. Befestigen Sie nun die in vitro Blasenmodelle an Klemmständern. Schließen Sie die Schläuche des Medienkreislaufs an die Schlauchpumpe an und befestigen Sie die Abfallbeutel in den Ständern, die unter den Modellen positioniert sind. Verbinden Sie die äußere Kammer des Blasenmodells mit einem Silikonschlauch mit einem zirkulierenden Wasserbad. Stellen Sie das Wasserbad auf 37 Grad Celsius ein und schalten Sie die Umwälzpumpen ein. Sterilisieren Sie das In-vitro-Blasenmodell mit 70 % Ethanol. Entfernen Sie den Stopfen am Medieneinlass, um die Innenkammer zugänglich zu machen. Entfernen Sie mit einer serologischen Pipette 10 Milliliter AUM aus dem Volumen des Blasenmodells. Die in vitro Blasenmodelle werden durch die zentrale Kammer mit der gesamten normalisierten 10-Milliliter-Suspension geimpft und gründlich gemischt. Entnehmen Sie mit der Pipette 10 Milliliter der inokulierten Probe aus der zentralen Kammer und aliquotieren Sie sie in ein 15-Milliliter-Universalröhrchen für spätere Assays. Nachdem Sie die Außenflächen dekontaminiert haben, setzen Sie den Stopfen wieder auf und nehmen Sie den Medienfluss kurz wieder auf, um sicherzustellen, dass der AUM-Spiegel in der zentralen Kammer das Augenloch erreicht, und stoppen Sie dann den Durchfluss. Schalten Sie nach einer einstündigen Inkubation den Medienfluss mit der Peristaltikpumpe ein, um mit dem Betrieb der In-vitro-Blasenmodelle zu beginnen. Nachdem Sie den Blasenstopfen dekontaminiert haben, entfernen Sie ihn, um Zugang zur zentralen Kammer zu erhalten. Mischen Sie den Inhalt der zentralen Kammer vorsichtig mit einer serologischen Pipette und vermeiden Sie dabei die Katheterspitze und den Ballon. Entnehmen Sie dann mit einer Pipette einen Milliliter aus der Probe und aliquotieren Sie ihn in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen für serielle Verdünnungen. Messen Sie den pH-Wert der verbleibenden Probe mit einem pH-Messgerät. Trennen Sie den Abfallbeutel vom Katheter und lassen Sie den Resturin aus dem Modell ab, indem Sie den Ballon entleeren. Entfernen Sie den Katheter mit einer sterilen Pinzette von der Unterseite des Modells. Legen Sie nun den entfernten Katheter auf ein steriles Brett und schneiden Sie den Katheter mit einem sterilen Skalpell an den erforderlichen Stellen für den Schnitt ein. Tauchen Sie den Katheterabschnitt mit einer sterilen Pinzette dreimal in steriles PBS, um nicht adhärente Zellen zu entfernen, und inkubieren Sie den vorbereiteten Katheterabschnitt 30 Minuten lang in 0,25 % Trypsin bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation beschallen Sie die Lösung, die den Katheter enthält, 10 Minuten lang. Führen Sie bei der aseptischen Technik das Ende der Spritze mit dem Schmiermittel in den Hals des Blasenmodells ein und injizieren Sie fünf Milliliter Gel. Drehen Sie das Modell, um sicherzustellen, dass die Basis gleichmäßig mit Gel beschichtet ist. Um einen Foley-Katheter in das Modell einzuführen, schieben Sie die Katheterspitze durch das Gel und sichern Sie sie, nachdem Sie den Ballon wie gewohnt gefüllt haben. Verbinden Sie das Modell mit dem Rest des Setups. Füllen Sie dann das Modelllumen mit Urin, bis er durch das Katheteraugenloch abzufließen beginnt. Sobald der Urin abzufließen beginnt, stoppen Sie die Pumpe, um einen Verlust des Gels vor der Impfung zu verhindern. Wenn die Pumpe nach der Inokulation eingeschaltet wird, verdünnen Sie die Verdünnungen für die Zählung der koloniebildenden Einheiten. Wenn Sie einen einzelnen Spülbeutel verwenden, trennen Sie den Abfallbeutel vom Katheter und verwenden Sie die mit dem Beutel gelieferte Kappe, um den Abfallbeutel zu verschließen. Befestigen Sie den Beutel für die Spüllösung sofort am Katheter und drücken Sie das Produkt mit leichtem Druck 15 Minuten lang gemäß den Anweisungen des Herstellers in das zentrale Lumen. Sobald die empfohlene Behandlungszeit abgelaufen ist, lassen Sie die restliche Lösung aus der inneren Kammer über das Katheter-Augenloch in den Spülbeutel abfließen und trennen Sie dann den Beutel. Sterilisieren Sie den Katheterdrainageanschluss und den Anschlussanschluss für den Abfallbeutel mit 70 % Ethanol, bevor Sie sie wieder anschließen. Um das Experiment zu beenden, schalten Sie den Wasserbadfluss aus und trennen Sie den Medienkreislauf und die Schläuche des Wasserbadkreislaufs von den In-vitro-Blasenmodellen. Nachdem Sie die Stopfen entfernt haben, sammeln Sie das gesamte Volumen des Resturins, entleeren Sie die Abfallbeutel und entsorgen Sie alle Medienreste. Trennen Sie dann die Katheterabfallbeutel vom Katheteranschluss und entsorgen Sie sie. Lassen Sie abschließend mit einer Spritze langsam die Luft aus den Katheterballons entleeren, bevor Sie die Katheter aus den Modellen entfernen. Nach der Inokulation des Blasenmodells war die Blockadezeit im mini-Tn5-Mutantenstamm von Proteus mirabilis im Vergleich zum Wildtyp-Stamm signifikant verlängert, was auf eine verminderte Biofilmbildung hinweist. Die planktonischen koloniebildenden Einheiten pro Milliliter zum Zeitpunkt der Blockade waren im mini-Tn5-Mutantenstamm im Vergleich zum Wildtyp signifikant reduziert. Die Kristallviolettfärbung zeigte, dass Proteus mirabilis-Isolate, die in Chlorhexidin passaget wurden, eine signifikante Verringerung der Biofilmbiomasse im Vergleich zu denen ohne Chlorhexidin aufwiesen. Die Behandlung von in vitro Blasenmodellen mit 0,02 % Chlorhexidin-Spülung verlängerte die Zeit bis zur Verstopfung signifikant und reduzierte die planktonischen koloniebildenden Einheiten pro Milliliter im Vergleich zu unbehandelten und mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollen.