Identifizierung von Mikroglia und peripher infiltrierenden Makrophagen im verletzten Rückenmark mittels Durchflusszytometrie

Unsere Forschung identifiziert Mikroglia und infiltrierende Makrophagen bei Rückenmarksverletzungen, um ihre Rolle bei der Neuroinflammation mit Hilfe einer optimierten Durchflusszytometrie zu klären. Durchflusszytometrie und Dichtegradientenzentrifugation sind der Schlüssel für die Isolierung und Phänotypisierung von Immunzellen des Zentralnervensystems mit hoher Spezifität und Effizienz. Die Unterscheidung morphologisch ähnlicher Mikroglia und Makrophagen, die Minimierung des Zellverlusts während der Isolierung und die minderwertige Mikrospezifität in dynamischen Verletzungsmikroumgebungen sind nach wie vor wichtige Hürden. Bestehende Methoden sind nicht in der Lage, residente Mikroglia zuverlässig von infiltrierenden Makrophagen zu unterscheiden. Unser markerbasierter Ansatz behebt diese kritische Einschränkung in Studien zu Rückenmarksverletzungen.

[Moderator] Analysieren Sie zunächst das Isotyp-Kontrollröhrchen mit dem Durchflusszytometer und der kompatiblen Software. Passen Sie die Spannungen für die Vorwärts- und Seitenstreuung an, um die Zellpopulation in einem geeigneten Bereich zu positionieren. Richten Sie zwei zusätzliche Diagramme ein, eines mit IgG APC auf der X-Achse und IgG PE auf der Y-Achse, eines mit IgG-FITC auf der X-Achse und IgG APC-Cy7 auf der Y-Achse. Passen Sie dann die Fluoreszenzkanalspannungen für IgG APC, IgG PE, IgG FITC und IgG APC-Cy7 an, um die Zellpopulation innerhalb der 10 hoch drei des doppelt negativen Bereichs zu positionieren. Nachdem Sie die optimierten Spannungen mit der Isotyp-Steuerröhre bestätigt haben, behalten Sie alle Einstellungen bei. Fahren Sie mit der Analyse der mit Antikörpern gefärbten Versuchsröhrchen fort. Erstellen Sie einen Graphen mit CD11b PE auf der X-Achse und Seitenstreuung auf der Y-Achse. Richten Sie einen weiteren Graphen mit CD68 FITC und CCR7 APC-Cy7 ein. Definieren Sie mit dem Isotypregler als Referenz den CD11b-positiven Bereich und definieren Sie ihn als P1-Gatter. Wählen Sie das Diagramm CD68 FITC und CCR7 APC-Cy7 aus. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, um "Population anzeigen" zu öffnen, und weisen Sie die Spalte F4 P1 zu. Passen Sie nach der Erfassung der Daten die Fluoreszenzkompensation nach Bedarf an. Analysieren und erfassen Sie den Prozentsatz der CD11b-, CD68-CCR7-positiven und CD11b-CD68-positiven CCR7-negativen Zellpopulationen. Beginnen Sie mit der Analyse der Versuchsröhren mit den Spannungseinstellungen der Isotyp-Steuerröhre. Erstellen Sie einen Graphen mit CD45 APC und CD11b PE. Richten Sie dann zwei Graphen mit CD68 FITC und CCR7 APC-Cy7 ein. Erfassen Sie 50.000 Ereignisse pro Probe und passen Sie die Fluoreszenzkompensation nach der Datenerfassung an. Identifizieren und analysieren Sie in den Pseudofarbendiagrammen von CD45 und CD11b die Regionen für CD11b-positive, CD45-negative niedrige und CD11b-positive CD45-Zellen mit hohem Niveau. Analysieren Sie dann die CD68-positiven CCR7-positiven und CD68-positiven CCR7-negativen Populationen in jeder Region. Integrieren Sie alle Analysen, um den Prozentsatz von M1-ähnlichen und M2-ähnlichen Mikroglia und Makrophagen in den definierten Regionen zu bestimmen. Starten Sie die Software für die Durchflusszytometrie-Analyse. Ziehen Sie die Durchflusszytometrie-Experimentdateien in den Abschnitt Alle Proben der Benutzeroberfläche. Doppelklicken Sie auf das Isotyp-Kontrollbeispiel, um ein zweidimensionales Punktdiagramm zu öffnen. Wählen Sie FSCA für die X-Achse und SSCA für die Y-Achse, klicken Sie auf die Schaltfläche für das rechteckige Tor und wählen Sie damit den Bereich ohne Zelltrümmer aus. Doppelklicken Sie auf den geschlossenen Bereich, um ein neues Histogrammdiagramm zu öffnen. Wählen Sie dann FITC für die X-Achse und Histogramm für die Y-Achse. Klicken Sie auf die Schaltfläche für das Region-Gate, um den Schwellenwert zwischen negativen und positiven Fluoreszenzsignalen zu definieren. Bestimmen Sie für jeden der vier fluoreszierenden Antikörper die Schwelle zwischen negativen und positiven Signalen anhand der Isotyp-Kontrollprobe. Ändern Sie nacheinander das Fluorochrom der X-Achse in PE-APC und APC-Cy7, während das Histogramm der Y-Achse beibehalten wird. Verwenden Sie das Region-Gate-Tool in jedem Histogramm, um die Gates für die Unterscheidung negativer und positiver Fluoreszenzsignale für die vier Antikörper zu finalisieren. Doppelklicken Sie anschließend auf die experimentelle Stichprobe, um ein Punktdiagramm zu öffnen. Wählen Sie FSCA für die X-Achse und SSCA für die Y-Achse. Klicken Sie auf die Schaltfläche für das rechteckige Tor, um die Population nach dem Entfernen von Ablagerungen zu begrenzen. Doppelklicken Sie auf den abgegrenzten Bereich, um ein neues Punktdiagramm zu öffnen. Wählen Sie CD11b PE für die X-Achse und SSCA für die Y-Achse. Klicken Sie auf die Schaltfläche für das rechteckige Gate und verwenden Sie den PE-Schwellenwert aus dem Isotyp-Steuerelement, um das CD11b-positive Gate zu definieren. Doppelklicken Sie nun auf den CD11b-positiven Bereich, um ein weiteres Punktdiagramm zu öffnen. Wählen Sie CD68 FITC für die X-Achse und CCR7 APC-Cy7 für die Y-Achse. Klicken Sie auf die Crossgate-Schaltfläche und verwenden Sie die von Isotypen abgeleiteten FITC- und APC-Cy7-Schwellenwerte, um Zellen in M1-ähnliche und M2-ähnliche Typen zu kategorisieren. Der Anteil der CD45-hohen CD11b-positiven CD68-positiven CCR7-positiven Zellen war in der Vehikelgruppe mit Rückenmarksverletzungen (SCI) im Vergleich zur Scheingruppe signifikant erhöht, und die Behandlung mit CRID3 veränderte dieses Niveau nicht. Der Anteil CD45-negativer niedriger CD11b-positiver CD68-positiver CCR7-positiver Zellen war in der SCI-Vehikelgruppe signifikant höher als bei Scheinzellen und war nach einer CRID3-Behandlung signifikant reduziert. Der Anteil der CD11b-positiven CD68-positiven CCR7-positiven Zellen war in der SCI-Vehikelgruppe im Vergleich zur Schein-Vehikel-Gruppe signifikant erhöht und nach der CRID3-Behandlung signifikant verringert. CD11b-positive, CD68-positive, CCR7-negative und CD45-negative niedrige CD11b-positive CD68-positive CCR7-negative Zellanteile waren in beiden SCI-Vehikelgruppen im Vergleich zu Schein-Vehikelgruppen signifikant verringert und nach CRID3-Behandlung erhöht.