Vorbereitung und Durchführung eines IsoPositiv-Käfig-Experiments zur Stuhltransplantation von Menschen in keimfreie Mäuse

Wir untersuchten die Interaktion zwischen Bakterien und dem Wirt, und unser interner und externer Faktor veränderte diese Beziehung, um die Gesundheit zu verändern. Insbesondere sind wir daran interessiert, die Rolle von Bakterien bei der Entwicklung, dem Fortschreiten und der Therapie von Krebs zu verstehen. Wir und andere Mikrobiomlabore verwenden ein ISO-positives Käfigsystem, um die Stuhlgemeinschaft vom Menschen in einen empfangenden Mauswirt zu übertragen, um eine stabile und langfristige mikrobielle Gemeinschaft zu schaffen.

Diese Technologie hat es uns ermöglicht, eine neue Entdeckung über die Rolle relevanter klinischer Bakterien bei Gesundheit und Krankheit zu machen. Viele prospektive klinische Studien haben Zusammenhänge zwischen bestimmten Mikroben und der Entwicklung, dem Fortschreiten und dem Ansprechen auf die Behandlung von Krebs gefunden, aber die Korrelation impliziert keine Kausalität. Die Humanisierung keimfreier Mäuse mit humanen Stuhlproben ermöglicht die Validierung des ursächlichen Zusammenhangs in relevanten Krebsmodellen.

Unter Verwendung des ISO-positiven Käfigsystems haben wir gezeigt, dass spezifische Bacteroides-Stämme von Patienten mit humanem Immuntherapie-Ansprechen, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, eine Reaktion auf Mäuse mit orthotopen Lungentumoren hervorrufen. Legen Sie zunächst 10 Tücher in den Tauchtank des Chlordioxid-Sterilisationsmittels und stellen Sie sicher, dass sie vollständig eingeseift sind. Füllen Sie dann mit einem Messzylinder einen großen Plastikbeutel mit mindestens 100 Millilitern Chlordioxid-Sterilisationsmittel.

Schütteln Sie den Beutel, um sicherzustellen, dass alle Innenflächen durchnässt sind, und legen Sie ihn beiseite. Nehmen Sie einen einzelnen ISO-Käfig aus dem Gestell und setzen Sie ihn in den Chlordioxid-Sterilisationsbehälter ein, um vollen Flüssigkeitskontakt zu gewährleisten. Verwenden Sie getränkte Tücher, um alle Käfigoberflächen zu schrubben.

Lassen Sie nach dem Einweichen des Käfigs einen Assistenten die eingeweichte Plastiktüte öffnen. Setzen Sie den Käfig hinein und schließen Sie sofort die Öffnung. Besprühen Sie die Beutelöffnung mit einer Sprühflasche mit Chlordioxid-Sterilisationsmittel.

Sobald alle Käfige und Vorräte eingetütet sind, tauchen Sie chemikalienbeständige Handschuhe in Chlordioxid-Sterilisationsmittel. Schieben Sie in der Zwischenzeit die eingeweichten Tücher in die Biosicherheitswerkbank und tränken Sie alle Oberflächen. Bei nicht geschützten Oberflächen drücken Sie die Tücher darüber, ohne sie zu berühren.

Bringen Sie nach 20 Minuten mit sterilisierten, chemikalienbeständigen Handschuhen jeden Käfig und jede Flasche in die sterilisierte Biosicherheitswerkbank. Um den hermetisch verschlossenen ISO-Käfig zu öffnen, heben Sie die weißen Laschen an den beiden Klammern an den Seiten des Deckels an und ziehen Sie jede Klemme seitlich heraus, um den Deckel zu entriegeln. Entfernen Sie mit der sterilen Pinzette im Käfig auf dem Gitterrost die leere Wasserflasche und legen Sie sie auf die Innenseite des Deckels.

Entfernen Sie die Gummidichtung und gießen Sie Wasser in die Flasche, um sie zu füllen. Setzen Sie die Düse mit einer sterilen Pinzette auf die Wasserflasche und drücken Sie sie fest nach unten, um sie zu verschließen. Heben Sie dann mit einer sterilen Pinzette das Drahtgestell an und schieben Sie es einige Zentimeter nach hinten, um eine Öffnung zum Käfigboden zu schaffen.

Legen Sie die sterile Pinzette auf das Gitter und stellen Sie sicher, dass die Griffe nicht mit den Käfigoberflächen in Berührung kommen. Lassen Sie den Assistenten nach Erhalt der Übertragungsscheibe die Kunststoffabdeckung festhalten und teilweise auswickeln, so dass die durchnässte Oberfläche freiliegen, aber nicht berührt wird. Nehmen Sie mit chemikalienbeständigen, mit Chlordioxid getränkten Handschuhen die Transferscheibe aus der Plastikverpackung und legen Sie sie auf eine ebene Fläche in der sterilisierten Biosicherheitswerkbank.

Um die Übertragungsscheibe zu öffnen, ziehen Sie das Klebeband ab, das den Scheibenumfang versiegelt, und entfernen Sie dann den Deckel. Manipulieren Sie dann mit der sterilen Pinzette, die zuvor auf dem Drahtgestell ruhte, den Fachdeckel, um die Öffnung mit der zu übertragenden Maus auszurichten. Fassen Sie mit einer sterilen Pinzette die Basis des Mausschwanzes durch die Öffnung in der Abdeckung der Übertragungsscheibe, heben Sie die Maus an und übertragen Sie sie durch die Öffnung zwischen dem Drahtgestell und dem Käfig in den ISO-Käfig.

Sobald alle Mäuse übertragen sind, ersetzen Sie das Drahtgestell durch die sterile Pinzette. Hebe den Käfigdeckel an und setze ihn wieder auf den Käfig. Heben Sie jede Klemme des Käfigdeckels an und senken Sie sie vorsichtig über die Seiten des Käfigs.

Drücken Sie die weißen Laschen nach unten, um den Käfigdeckel sicher zu verschließen. Lassen Sie nun den Assistenten jede Düse der Andockstelle auf dem Käfigrost mit Chlordioxid-Sterilisationsmittel besprühen. Nehmen Sie den Käfig aus der Biosicherheitswerkbank und docken Sie ihn an das Käfiggestell an.

Dawn einen neuen sterilen OP-Kittel und sterile OP-Handschuhe anstelle der chemikalienbeständigen Handschuhe. Um die Sondennadeln vorzubereiten, wickeln Sie jeden Sterilisationsbeutel aus und verwenden Sie das Innere des Beutels als trockene, sterile Ruhefläche. Verbinden Sie die Sondennadel mit der Spritze.

Öffnen Sie das Fäkalienröhrchen und ziehen Sie 200 Mikroliter der Aufschlämmung in jede Spritze auf. Fassen Sie mit einer Pinzette die Basis des Mausschwanzes und legen Sie ihn auf das Drahtgestell. Halten Sie die Maus vorsichtig fest, indem Sie die lose Haut hinter dem Hals abscheuern.

Halten Sie die Maus in einer aufrechten vertikalen Position, führen Sie die Sondennadel ein und injizieren Sie vorsichtig den Stuhlaufschlämm. Entfernen Sie die Nadel sofort nach der Injektion. Legen Sie die Maus zur Beobachtung direkt in einen der sterilisierten Becher.

Nachdem alle Mäuse die Sonde erhalten haben, befördern Sie jede Maus mit einer Pinzette zurück in das Käfigbett. Die humanisierte Struktur der Stuhlgemeinschaft von Mäusen unterschied sich signifikant zwischen den Reaktionsphänotypen zu allen drei Zeitpunkten. Die Responder-Mäuse, die mit Kot besiedelt wurden, zeigten keinen Unterschied in der Struktur der mikrobiellen Gemeinschaft zwischen der ersten und zweiten Woche sowie den Wochen zwei und vier.

Während Non-Responder-Kot besiedelt wurde, zeigten Mäuse zwischen der ersten und zweiten Woche eine unterschiedliche Struktur der mikrobiellen Gemeinschaft, aber eine ähnliche Struktur zwischen der zweiten und vierten Woche. Die humanen Spenderinokula zeigten eine erhöhte Repräsentation von Blautia, Eubacterium, Ruminococcus und Streptokokken, während Empfängermäuse eine erhöhte relative Abundanz von Bacteroides, Lachnoclostridium, Marvinbryantia und Parabecteroides aufwiesen.