Chemogenetische Regulation in reprogrammierten Stammzell-abgeleiteten Vorläuferzellen bei der Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen

Unsere Forschung konzentriert sich auf die Veranschaulichung des pathogenen Mechanismus, der neurodegenerativen Erkrankungen zugrunde liegt, und integriert gleichzeitig fortschrittliche Technologien, um effektive Zelltherapietechniken für klinische Anwendungen zu entwickeln. In unserer jüngsten Arbeit transplantierten wir chemogenetisch veränderte Stammzellen in Mausmodellen der Parkinson-Krankheit. Wir modulieren die Neuronenaktivitäten einer Zelle mit Designerdrogen, also elektrophysiologisches Monitoring und Verhaltensbewertung. Wir nutzen CRISPR hauptsächlich für die Gentechnik, Elektrophysiologie zur Überwachung der neuronalen Aktivität und Verhaltensassays zur Bewertung der Funktionswiederherstellung in Parkinson-Modellen. Die Effizienz von Transplantatzellen steigt mit der richtigen Indikation, dem Überleben und dem funktionellen Beitrag zum Wirtsgewebe in der stammzellbasierten Therapie zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen. Unkontrollierte zelluläre Aktivität im Zusammenhang mit negativen Folgen, einschließlich der Tumorgenese.

Die Nutzung von Technologie in menschlichen reprogrammierten Stammzellen und Treiberneuronen bietet die Möglichkeit, neuronale Aktivitäten durch die Verabreichung des Designermedikaments CNO präzise zu steuern.

[Dozent] Mischen Sie zunächst vorsichtig 50 bis 100 Nanogramm des linearisierten Vektors, Fragment eins und Fragment zwei, in einem molaren Verhältnis von ein bis drei bis drei Molen, zusammen mit der 2-fachen Klonierungsmischung. Inkubieren Sie die Mischung eine Stunde lang bei 55 Grad Celsius, um die homologe Rekombination mit Hilfe der Gibson-Assemblierung zu erleichtern. Fügen Sie die Guide-RNA, die auf die AAVS1-Stelle abzielt, in die BBS1-Stelle des PX458-Vektors ein. Bewahren Sie die reprogrammierten Stammzellen in Kulturmedien auf, wobei eine Zelldichte zwischen zwei und 5 Millionen Zellen pro Milliliter angestrebt wird. Mischen Sie nun zwei bis 5 Millionen Zellen, zwei Mikrogramm jedes Donorplasmids und zwei Mikrogramm GRNA-Plasmid in 100 Mikroliter Elektroporationspuffer. Übertragen Sie das Zell-Plasmid-Gemisch in eine Küvette, um die Elektroporation durchzuführen. Als nächstes werden die elektroporierten Zellen in Sechs-Well-Platten überführt, die mit Poly-D-Lysin und Laminin beschichtet wurden. Verteilen Sie ca. 500.000 Zellen pro Vertiefung in zwei Millilitern Kulturmedium. Verwenden Sie nach 72 Stunden Elektroporation ein Durchflusszytometer, um fluoreszierende positive Zellen zu sortieren. Konfigurieren Sie den Sortierer mit dem FITC-Kanal für die ZsGreen-Erkennung. Nehmen Sie unbehandelte induzierte neurale Stammzellen als Negativkontrollen auf, um die Ausgangsfluoreszenz zu definieren. Einzelne ZsGreen-positive Zellen in 96-Well-Platten füllen, die mit Poly-D-Lysin und Laminin vorbeschichtet sind, und 200 Mikroliter Kulturmedium pro Vertiefung hinzufügen. Bewahren Sie die Kultur sieben bis 14 Tage lang auf. Isolieren Sie einzelne Klone, die Fluoreszenz aufweisen, mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop, das mit einem grün fluoreszierenden Proteinfilterset ausgestattet ist. Nachdem Sie die positiven Zellen auf beschichteten 48-Well-Platten expandiert haben, teilen Sie sie in zwei Teile, einen für die fortgesetzte Kultur und den anderen für die Genotypisierung. Extrahieren Sie genomische DNA aus den Klonkandidaten. Bereiten Sie eine PCR-Mischung mit zwei Prime-Reparaturen vor, eine zur Bestätigung der Insertion des interessierenden Gens und eine andere zur Unterscheidung zwischen homozygoten und heterozygoten Klonen. Verdauen Sie die Zellen, waschen Sie sie in PBS und zentrifugieren Sie sie drei Minuten lang bei 250 g. Führen Sie einseitige stereotaktische Injektionen von drei Mikrolitern 6-Hydroxydopamin in einer Konzentration von fünf Mikrogramm pro Mikroliter auf das anästhesierte Tier durch. Richten Sie das rechte Corpus Striatum mit den richtigen Koordinaten aus. Verabreichen Sie vier Wochen nach der Operation eine intraperitoneale Injektion von Apomorphin in einer Menge von einem Milligramm pro Kilogramm mit einer in Kochsalzlösung gelösten Lösung von 0,5 Milligramm pro Milliliter, um die Läsionen zu validieren. Verabreichen Sie eine stereotaktische Injektion von vier Mikrolitern der vorbereiteten Zellsuspension in das Mausmodell der Parkinson-Krankheit. Führen Sie den Zylindertest zu mehreren Zeitpunkten nach der Zelltransplantation durch. Stellen Sie einen Glasbecher mit einem Durchmesser von 20 Zentimetern und einer Höhe von 30 Zentimetern auf eine ebene, nicht reflektierende Fläche. Positionieren Sie dann eine Draufsichtkamera über dem Zylinder, um den vollen Durchmesser zu erfassen. Platzieren Sie jede Maus in der Mitte des Zylinders und starten Sie die gleichzeitige Videoaufzeichnung für drei Minuten pro Sitzung. Bringen Sie die Maus nach der Sitzung wieder in ihren Ausgangskäfig zurück. Beurteilen Sie die Bewegung der oberen Gliedmaßen der Mäuse während der dreiminütigen Sitzung. Berechnen Sie die Anzahl der Wandkontakte, die von der beeinträchtigten Vordergliedmaße hergestellt wurden, im Verhältnis zur Gesamtzahl der Kontakte, die von beiden Vordergliedmaßen hergestellt wurden. Verabreichen Sie entweder Kochsalzlösung oder Clozapin-N-Oxid in einer Dosierung von 1,2 Milligramm pro Kilogramm durch intraperitoneale Injektion. Führen Sie den Zylindertest erneut durch, um die Verhaltensmodulation im Mausmodell der Parkinson-Krankheit nach Verabreichung von Clozapin N-Oxid zu beurteilen. Nachdem Sie das Gehirn aus dem betäubten Tier extrahiert und sofort in eiskalte künstliche Zerebrospinalflüssigkeit auf Saccharosebasis gelegt haben, um die Zellintegrität zu erhalten, schneiden Sie das Gehirn mit einem Vibratom in Abschnitte von 300 bis 400 Mikrometern Dicke. Passen Sie die Gaseingangseinstellungen so an, dass sie mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid bei 34 Grad Celsius ausgleichen. Übertragen Sie die Gehirnschnitte in eine Kammer, die mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit gefüllt ist. Beladen Sie Glaspipetten mit vereister intrazellulärer Lösung, um sicherzustellen, dass der Elektrodenwiderstand zwischen sieben und 10 Megaohm liegt. Montieren Sie die Scheiben in einer untergetauchten Aufnahmekammer, die bei zwei Millilitern pro Minute mit sauerstoffreicher künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit bei 34 Grad Celsius überflogen wird. Positionieren Sie Pipetten mit motorisierten Mikromanipulatoren unter Infrarot-Differenzinterferenz-Kontrastmikroskopie. Stellen Sie die Konfiguration der gesamten Zelle durch sanftes Saugen her, um Neuronen mit einem Widerstand von mehr als einem Gigaohm zu pflastern. Klemmen Sie die Zellen mit einem Patch-Clamp-Verstärker bei minus 70 Millivolt und erfassen Sie acht Minuten lang spontane exzitatorische postsynaptische Basisströme mit einer Abtastrate von 10 Kilohertz. Geben Sie 50 mikromolare Clozapin N-Oxid unmittelbar nach der Basismessung in die Aufzeichnungskammer. Setzen Sie die Datenaufzeichnung 16 Minuten lang fort und überwachen Sie Änderungen der spontanen exzitatorischen postsynaptischen Stromfrequenz oder -amplitude. Führen Sie abschließend ein Auswaschverfahren durch, indem Sie die Clozapin-N-Oxid-Lösung durch frische künstliche Zerebrospinalflüssigkeit ersetzen und mit der Aufzeichnung fortfahren, um die Wiederherstellung der synaptischen Aktivität zu bewerten. Die hämogenetische Modulation mit Clozapin-N-Oxid reduzierte die kontralaterale Bewegung der Vordergliedmaßen bei hM4Di-transplantierten Mäusen und erhöhte sie bei hM3Dq-transplantierten Mäusen im Vergleich zur Kochsalzlösung, was eine bidirektionale Verhaltenskontrolle zeigt. Elektrophysiologische Ableitungen zeigten, dass hM4Di-transplantierte Zellen längere Intervalle und kleinere Spitzenamplituden in spontanen exzitatorischen postsynaptischen Strömen aufwiesen, während hM3Dq-transplantierte Zellen kürzere Intervalle und größere Amplituden aufwiesen, was auf eine entsprechende Unterdrückung und Erhöhung der synaptischen Aktivität hinweist. Die Immunfluoreszenzanalyse bestätigte die in vivo Expression von Tyrosinhydroxylase und ZsGreen in den transplantierten hM4Di- und hM3Dq-Zellen, was eine erfolgreiche Transplantatintegration unterstützt.