Name: Generierung apikaler Darmorganoide und Bestimmung der Organoid-Proliferationsrate mittels EdU-Markierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T14:57:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie apikale Darmorganoide aus adulten Stammzellen generieren und die Proliferationsrate mittels EdU-Markierung quantifizieren. Diese Methode ermöglicht den Zugang zur apikalen Zelloberfläche für verbesserte Analysen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+suppresses+Wnt+signaling+via+the+Bcl11b-regulated+NuRD+complex+to+maintain+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">BMP suppresses Wnt signaling via the Bcl11b-regulated NuRD complex to maintain intestinal stem cells.</a> EMBO J. 43 (23), 6032-6051 (2024).</li>
<li>Gaowa, A., Leangpanich, S., Park, E. J., Kawamoto, E., Shimaoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irisin+promotes+intestinal+epithelial+cell+proliferation+via+Wnt%2F%CE%B2-catenin+and+focal+adhesion+kinase+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Irisin promotes intestinal epithelial cell proliferation via Wnt/β-catenin and focal adhesion kinase signaling pathways.</a> Sci Rep. 14, 25702(2024).</li>
<li>Basak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+quiescence+of+Lgr5%2B+stem+cells+in+intestinal+organoids+enables+differentiation+of+hormone-producing+enteroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced quiescence of Lgr5+ stem cells in intestinal organoids enables differentiation of hormone-producing enteroendocrine cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (2), 177-190 (2017).</li>
<li>Ludikhuize, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+define+intestinal+stem+cell+differentiation+downstream+of+a+FOXO%2FNotch+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Mitochondria define intestinal stem cell differentiation downstream of a FOXO/Notch axis.</a> Cell Metab. 32 (5), 889-900.e7 (2020).</li>
<li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%281979%29%22%5BJournal%5D)">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science (1979). 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+bat+and+human+intestinal+organoids+by+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2.</a> Nat Med. 26 (7), 1077-1083 (2020).</li>
<li>Joo, S. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+intestinal+apical-out+organoid+model+for+gut+function+study%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study.</a> Animals. 12 (3), 372(2022).</li>
<li>Co, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+epithelial+polarity%3A+A+human+enteroid+model+for+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Controlling epithelial polarity: A human enteroid model for host-pathogen interactions.</a> Cell Rep. 26, 2509-2520.e4 (2019).</li>
<li>Sasaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+scalable+coculture+system+for+gut+anaerobes+and+human+colon+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Development of a scalable coculture system for gut anaerobes and human colon epithelium.</a> Gastroenterology. 159 (1), 388-390.e5 (2020).</li>
<li>Mayorgas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+to+study+the+invasive+capability+of+adherent-invasive+escherichia+coli+by+using+human+primary+organoid-derived+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">A novel strategy to study the invasive capability of adherent-invasive escherichia coli by using human primary organoid-derived epithelial monolayers.</a> Front Immunol. 12, 646906(2021).</li>
<li>Csukovich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralising+effects+of+different+antibodies+on+clostridioides+difficile+toxins+TcdA+and+TcdB+in+a+translational+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Neutralising effects of different antibodies on clostridioides difficile toxins TcdA and TcdB in a translational approach.</a> Int J Mol Sci. 24 (4), 3867(2023).</li>
<li>Csukovich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+reversal+of+canine+intestinal+organoids+reduces+proliferation+and+increases+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Polarity reversal of canine intestinal organoids reduces proliferation and increases cell death.</a> Cell Prolif. 57 (2), e13544(2023).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+differentiating+and+long-living+intestinal+organoids+reflecting+the+cellular+diversity+of+canine+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of differentiating and long-living intestinal organoids reflecting the cellular diversity of canine intestine.</a> Cells. 9 (4), 822(2020).</li>
<li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106(2020).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., O'Connor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+infection+in+3D+tissue-derived+human+organoid+culture+systems+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Studying infection in 3D tissue-derived human organoid culture systems by microinjection.</a> J Vis Exp. (151), e59610(2019).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+SLC26A3+expression+and+function+in+intestinal+epithelial+cells+in+response+to+Cryptosporidium+parvum+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Decreased SLC26A3 expression and function in intestinal epithelial cells in response to Cryptosporidium parvum infection.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 317 (6), C1205-C1212 (2019).</li>
<li>Dutta, D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+culture+systems+to+study+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Organoid culture systems to study host-pathogen interactions.</a> Curr Opin Immunol. 48, 15-22 (2017).</li>
<li>Csukovich, G., Pratscher, B., Burgener, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+world+of+organoids%3A+Gastrointestinal+disease+modelling+in+the+age+of+3R+and+one+health+with+specific+relevance+to+dogs+and+cats%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">The world of organoids: Gastrointestinal disease modelling in the age of 3R and one health with specific relevance to dogs and cats.</a> Animals. 12 (18), 2461(2022).</li>
<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+a+more+perfect+union%3A+Modeling+intestinal+bacteria-epithelial+interactions+using+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Creating a more perfect union: Modeling intestinal bacteria-epithelial interactions using organoids.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 12 (2), 769-782 (2021).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+porcine+intestinal+organoids%3A+an+apical-out+organoid+model+for+swine+enteric+virus+infection+and+immune+response+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations.</a> J Virol. 94 (21), e01006-e01020 (2020).</li>
<li>Smith, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+ovine+gastric+and+intestinal+organoids+for+studying+ruminant+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The development of ovine gastric and intestinal organoids for studying ruminant host-pathogen interactions.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 733811(2021).</li>
<li>Nash, T. J., Morris, K. M., Mabbott, N. A., Vervelde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inside-out+chicken+enteroids+with+leukocyte+component+as+a+model+to+study+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Inside-out chicken enteroids with leukocyte component as a model to study host-pathogen interactions.</a> Commun Biol. 4 (1), 377(2021).</li>
<li>Hanson, K. I., Weiss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+tissue+response+to+Shiga+toxin+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Intestinal tissue response to Shiga toxin exposure.</a> mBio. 15 (9), e0123224(2024).</li>
<li>Hovhannisyan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+human+organoids+supports+an+intestinal+niche+for+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Infection of human organoids supports an intestinal niche for Chlamydia trachomatis.</a> PLoS Pathog. 20 (8), e1012144(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>24-Well-Platten</td><td>Biologix</td><td>07-6024</td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I human, &ge; 95% (HPLC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-9145</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide 18 Well Glass</td><td>Bottom ibidi</td><td>81817</td><td></td></tr><tr><td>100X Penicillin-Streptomycin supplement for Media</td><td>Gibco/Thermo</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>A 83-01&nbsp;</td><td>Tocris Bioscience</td><td>2939/10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Adhärenz-Spüllösung</td><td>StemCell Technologies</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>arivis Pro&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Version 4.2.2</td><td></td></tr><tr><td>B27 SerumFree Supplement (50X), flüssig</td><td>Gibco/Thermo</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342)</td><td>Abcam</td><td>ab145597</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Zellproliferationskit für die Bildgebung, Alexa Fluor 647 Farbstoff</td><td>Thermo Scientific</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco/Thermo</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Gibco/Thermo</td><td>A1413202</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Ergänzung&nbsp;</td><td>Gibco/Thermo</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Puffer Lösung 1 M, flüssig</td><td>Gibco/Thermo</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF-basic</td><td>PeproTech</td><td>100-18B-100&micro; G</td><td></td></tr><tr><td>Mensch HGF&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>100-39-100&Mikro; G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Menschliches IGF-I&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>100-11-100&Mikro; G</td><td></td></tr><tr><td>Menschliches NOGGIN (Säugetier)&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>120-10C-200 & Mikro G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetyl-L-cystein, Zellkultur getestet, BioReagenz &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Organoide Entnahmelösung</td><td>Thermo</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>Triton(TM) X-100, für die Molekularbiologie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), phenolrot</td><td>Gibco/Thermo</td><td>25300054</td><td></td></tr></tbody></table>

generierung apikaler darmorganoide und bestimmung der organoid-proliferationsrate mittels edu-markierung

Generation of Apical-Out Intestinal Organoids and Assessment of Organoid Proliferation Rate Using EdU-Labeling

Organoide, die 3 Tage nach der Trypsinisierung gezüchtet werden, sollten idealerweise zwischen 50 und 250 μm liegen, wie in Abbildung 2A dargestellt. Organoide, die deutlich größer sind, kehren ihre Polarität möglicherweise nicht effizient um. Größere Organoide können auch anfangen zu knospen, und wir haben festgestellt, dass diese Organoide auch Probleme mit einer effizienten Polaritätsumkehr haben können. Basal-out- und apikal-out-Organoide weisen bereits in der Hellfe...

Generierung apikaler Darmorganoide und Bestimmung der Organoid-Proliferationsrate mittels EdU-Markierung

Here, we describe the generation of floating cultures of apical-out intestinal organoids from hydrogel-embedded intestinal organoid cultures. ...

generation-apical-out-intestinal-organoids-assessment-organoid

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eine einfache Methode zur primären murinen Kolontumor organoide etablieren beschrieben. Dieses Verfahren nutzt die Eigenschaft, dass Kolontumorzellen überleben und wachsen in Organoiden in Medien, die begrenzte Wachstumsfaktoren, während normale Kolonepithelzellen nicht tun.

In-vitro-Kultur von Organoide Primäre Maus Kolontumoren

Hier wird ein Protokoll zu ernten, zu pflegen und zu behandeln Maus kleine Darm-Organoide mit pathogen associated molecular patterns (PAMPs) und Listeria monocytogenes beschrieben, sowie Betonung auf die Genexpression und die richtige Normalisierungstechniken für Protein.

Das<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur und Mustererkennung Rezeptor-Stimulation von Maus-Darm-Organoide

Intestinale organoide Kulturen werden aus ganzen Krypten und erlauben nicht die Analyse der Selbsterneuerung und Differenzierung in eine Zelle-spezifische Art und Weise. Dieses Protokoll beschreibt Rekonstitution der sortierten Stamm (Lgr5+) und Nische (Paneth) Zellen, die Organellen hervorrufen und ermöglicht ihre vorherige biochemische und genetische Modifikation und Funktionsanalyse.

Die organoide Rekonstitution Assay (ORA) für die funktionelle Analyse von intestinale Stammzellen und Nische Zellen

Die Brustdrüse ist eine zweischichtige Struktur, die äußere myoepitheliale und innere luminale Epithelzellen umfasst. Präsentiert ist ein Protokoll zur Vorbereitung von Organoiden mit Differential-Trypsinisierung. Diese effiziente Methode ermöglicht es Forschern, diese beiden Zelltypen getrennt zu manipulieren, um Fragen über ihre Rolle in der Form und Funktion der Brustdrüse zu untersuchen.

Generierung von Mosaik-Mammary-Organoiden durch Differential-Trypsinisierung

Dieses Protokoll ermöglicht die Differenzierung menschlicher pluripotenter Zellen in Darmorganoide. Das Protokoll ahmt die normale menschliche Entwicklung nach, indem es Zellen in eine Population von definitivem Endoderm, Hinterdarm-Endoderm und dann Darmepithel differenziert. Dadurch eignet sich das Protokoll sowohl für die Untersuchung der Darmentwicklung als auch für Anwendungen zur Modellierung von Krankheiten.

Generierung von hiPSC-abgeleiteten Darmorganoiden für Entwicklungs- und Krankheitsmodellierungsanwendungen

Hier beschreiben wir die Herstellung von humanen Organoid-abgeleiteten intestinalen Epithel-Monolayern zur Untersuchung der Darmbarrierefunktion, Permeabilität und des Transports. Da Organoide die ursprüngliche Reaktion des Epithelgewebes auf äußere Reize darstellen, kombinieren diese Modelle die Vorteile der Erweiterbarkeit von Zelllinien und die Relevanz und Komplexität von Primärgewebe.

Organoid-abgeleitete Epithel-Monolayer: Ein klinisch relevantes In-vitro-Modell für die Darmbarrierefunktion

Hier stellen wir zwei Protokolle vor, die die Modellierung von intestinalen apikal-spezifischen Interaktionen ermöglichen. Organoid-abgeleitete intestinale Monoschichten und Air-Liquid-Interface (ALI)-Kulturen erleichtern die Erzeugung von gut differenzierten Epithelien, die sowohl von luminaler als auch von basolateraler Seite zugänglich sind, während polaritätsinvertierte Darmorganoide ihre apikale Seite freilegen und für Hochdurchsatz-Assays zugänglich sind.

Kulturmethoden zur Untersuchung apikal-spezifischer Wechselwirkungen mit intestinalen Organoidmodellen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Darmorganoide von Ratten zu generieren und sie in verschiedenen Downstream-Anwendungen zu verwenden. Ratten sind oft ein bevorzugtes präklinisches Modell, und das robuste intestinale Organoidsystem erfüllt den Bedarf an einem In-vitro-System zur Begleitung von In-vivo-Studien.

Generierung und Manipulation von Ratten-Darm-Organoiden

Diese Studie skizziert ein Protokoll zur Erzeugung von 2D-Monolayern von Schweineorganoiden, die aus dem Dünn- und Dickdarm stammen. Das Wachstum dieser Monoschichten ist durch steigende TEER-Werte gekennzeichnet, was auf eine robuste epitheliale Integrität hinweist. Darüber hinaus zeigten diese Monoschichten physiologische sekretorische Reaktionen in Ussing-Kammerexperimenten nach der Anwendung von Forskolin.

Zweidimensionale Organoide des Schweine-Darms, die die physiologischen Eigenschaften des nativen Darms widerspiegeln

Dieses Protokoll erklärt primären Lgr5-positve Organoid Kultur und die anschließende Leistung der retroviralen Transduktion. Dies ermöglicht Cre-induzierbare Überexpression oder Knockdown der gelieferten Transgen und ermöglicht funktionelle Studien im organotypischen neues in vitro durchgeführt werden   Modellsystem.

Ein Video-Protokoll von retrovirale Infektion in der Grunddarm Organoide Kultur

Erfahren Sie, wie Sie apikale Darmorganoide aus adulten Stammzellen generieren und die Proliferationsrate mittels EdU-Markierung quantifizieren. Diese Methode ermöglicht den Zugang zur apikalen Zelloberfläche für verbesserte Analysen.

Generierung apikaler Darmorganoide und Bestimmung der Organoid-Proliferationsrate mittels EdU-Markierung

Weitere Videos entdecken