Tiermodell für implantatassoziierte Infektionen bei Mäusen

Die Etablierung eines stabilen Tiermodells bietet uns zuverlässige Plattformen für die Erprobung implantatassoziierter Infektionstherapien bei gleichzeitiger Untersuchung pathologischer Statik und Immunantwort in der Mikroumgebung der Infektion. Im Kampf gegen die PGI-Behandlung bieten neue Techniken wie Fluoreszenzbildgebung, Elektronenmikroskop und Transkriptomik eine leistungsstarke Wahl für die Untersuchung der Lebenszyklen und der Zukunft von Bakterien bei PGI. Zunächst gilt es jedoch, ein qualitativ hochwertiges und reproduzierbares Tiermodell g.g.A. zu etablieren.

Die Herausforderung besteht nun darin, ein stabiles, reproduzierbares Modell zu konstruieren, das die komplexe In-vivo-Mikroumgebung nachahmt, eine klinische Realität für implantatassoziierte Infektionen. Implantat-assoziierte Infektionsmodelle sind subkutanen Abszessmodellen überlegen und bieten eine erhöhte klinische Relevanz, halten Infektionen aufrecht, verbessern die Reproduzierbarkeit und erhöhen die Biosicherheit. Diese Modellierungsmethode ist sehr sicher und zuverlässig, ermöglicht uns eine umfassende Untersuchung pathophysiologischer Mechanismen und regt die Entwicklung diagnostischer Kriterien mit gezielten therapeutischen Dehnungen an.

Besorgen Sie sich zunächst Kulturen von Staphylococcus aureus. Entfernen Sie eine Schlinge voll der Kultur mit einer Impfschlaufe, streichen Sie die Suspension auf eine Blutagarplatte und inkubieren Sie. Wählen Sie eine einzelne, runde und glatte, unabhängige Kolonie mit goldgelber Pigmentierung und einer klaren Hämolysezone.

Impfen Sie es mit einer sterilen Schlaufe in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das fünf Milliliter sterile tryptische Sojabrühe enthält. Legen Sie das Röhrchen in einen auf 37 Grad Celsius eingestellten Schüttelinkubator und schütteln Sie es 12 Stunden lang mit 200 Umdrehungen pro Minute. Die Bakteriensuspension mit tryptischer Sojabrühe im Verhältnis eins zu 50 verdünnen und erneut inkubieren.

Verwenden Sie dann ein Spektralphotometer, um die optische Dichte bei 600 Nanometern zu messen und aufzuzeichnen, um zu bestätigen, dass die Bakterien die logarithmische Wachstumsphase erreicht haben. Pipettieren Sie anschließend drei Milliliter der Bakteriensuspension in ein Röhrchen. Mischen Sie es mit drei Millilitern kaltsterilem PBS.

Zentrifugieren Sie die Mischung bei 3000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette und resuspendieren Sie das Bakterienpellet vorsichtig in PBS. Resuspendieren Sie das gewaschene Bakterienpellet in PBS für weitere Experimente.

Teilen Sie 20 C57BL bar 6J-Wildtyp-Mäuse nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen der implantatassoziierten Infektionsgruppe und der subkutanen Abszessgruppe auf. Wenden Sie für jede Maus unterschiedliche Ohrmarken an, um sie individuell zu identifizieren. Nachdem Sie die Haut der Tiere betäubt und vorbereitet haben, verwenden Sie sterile chirurgische Klingen, um einen Zentimeter großen Schnitt in der Rückenregion jeder Maus zu machen.

Setzen Sie dann ein steriles Titanimplantat in die durch den Schnitt entstandene Unterhauttasche ein. Injizieren Sie nun mit einer sterilen Ein-Milliliter-Spritze 100 Mikroliter Staphylococcus aureus-Bakteriensuspension direkt auf die Titanoberfläche. Bei der subkutanen Abszessgruppe wird der Schnitt direkt ohne Einsetzen des Implantats angelegt, desinfiziert und vernäht.

Injizieren Sie 100 Mikroliter Staphylococcus aureus-Suspension mit einer sterilen Ein-Milliliter-Spritze in die Inzisionsstelle. Um die Infektionen im peripheren Gewebe zu beurteilen, geben Sie die entnommene Gewebeprobe in ein steriles Röhrchen. Geben Sie eine gleiche Masse steriles PBS und drei sterile Mahlkugeln aus Stahl in jedes Röhrchen.

Homogenisieren Sie das Gewebe in drei Zyklen bei 70 Hertz für jeweils 60 Sekunden mit einer Pause von 20 Sekunden zwischen den Zyklen. Nach der Homogenisierung werden die Proben fünf Minuten lang vortext. Bereiten Sie nun serielle Verdünnungen des Gewebehomogenats mit PBS vor.

Mit einer Mikropipette 15 Mikroliter jedes verdünnten Homogenats auf die dafür vorgesehenen Abschnitte der Blutagarplatten tropfen. Dann inkubieren Sie die Blutagarplatten bei 37 Grad Celsius ohne Schütteln für 24 Stunden. Die implantatassoziierte Infektionsgruppe entwickelte am dritten Tag eine sichtbare Wundruptur.

An Tag 10 zeigten beide Gruppen von Mäusen Anzeichen einer Wundheilung, wobei die Gruppe mit dem subkutanen Abszess an Tag 14 eine ausgeprägtere Erholung zeigte als die Gruppe der implantatassoziierten Infektionen. Bakterienkulturen aus infiziertem Gewebe zeigten zu jedem Zeitpunkt ein anhaltend hohes bakterielles Wachstum in der implantatassoziierten Infektionsgruppe, während die subkutane Abszessgruppe von Tag drei bis Tag 14 eine fortschreitende Reduktion der Bakterienkolonien zeigte. Die Rasterelektronenmikroskopie zeigte eine zunehmend dichte bakterielle Bedeckung auf den Titanblechen in der implantatassoziierten Infektionsgruppe von Tag drei bis Tag 14.

Die Giemsa-Färbung zeigte eine deutliche Abnahme der Bakterien in der Gruppe der subkutanen Abszesse bis zum Tag 14, während die Gruppe der implantatassoziierten Infektionen während des gesamten Zeitraums eine hohe bakterielle Präsenz aufwies. Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen zeigten, dass die Infiltration von Entzündungszellen in der Gruppe mit subkutanen Abszessen bis zum Tag 14 signifikant abnahm, während die Gruppe mit implantatassoziierten Infektionen eine anhaltend dichte zelluläre Infiltration aufwies. Die histologische Untersuchung von Herz-, Leber-, Milz-, Lungen- und Nierengewebe zeigte in der implantatassoziierten Infektionsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe keine sichtbaren Läsionen oder Anomalien.