Name: Lebendzell-Förster-Resonanz-Energietransfer-Bildgebung der metabolisch regulierten Akt-Aktivierungsdynamik in HepG2-Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Erfahren Sie die FRET-Bildgebung zur Analyse der Akt-Aktivierungsdynamik in lebenden HepG2-Zellen. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Einblicke in Insulinsignalwege und metabolische Regulation bei Leberkrebs.

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<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>Kat#25200-056</td><td>Verwenden Sie eiskaltes PBS für die Zellwäsche</td></tr><tr><td>15 mm Zellkulturschale mit Glasboden</td><td>NEST</td><td>Kat#801001</td><td></td></tr><tr><td>2&nbsp; mL Nalgene Kryo-Fläschchen</td><td>Thermo Scientific</td><td>Kat#5012-0020</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Stripette serologische Pipets</td><td>Corning</td><td>Kat#4487</td><td></td></tr><tr><td>95% Ethanol</td><td>Kermel</td><td>Katze#C028005</td><td></td></tr><tr><td>A1 HD25/A1R HD25 Konfokalmikroskop</td><td>Nikon</td><td>https://www.nikon.com/</td><td>Vergrößerung: 40-fach, Numerische Apertur (NA): 1,30, Pixelverweilzeit: 2,4 ms, Pixelgröße: 1024</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kat#A9393</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>VWR Biowissenschaften</td><td>Kat#N208-10g</td><td></td></tr><tr><td>Corning 25&nbsp; CM2 rechteckige Kulturflaschen</td><td>Corning</td><td>Katze#430639</td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 automatisierter Zellzähler</td><td>Thermo Scientific</td><td>http://www.thermofisher.com/#AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>Countess Zellzählkammer Objektträger</td><td>Thermo Scientific</td><td>http://www.thermofisher.com/#C10228</td><td></td></tr><tr><td>Digitale Vortex-Mischer</td><td>Thermo Scientific</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kat#D2650</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Rohre 1,5&nbsp; Ml</td><td>Eppendorf</td><td>Katze#022363204</td><td></td></tr><tr><td>EZ-PCR Mykoplasmen-Nachweiskit</td><td>Biologische Industrien</td><td>Kat# 20-700-20</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, qualifiziert, Australien</td><td>Gibco</td><td>Katze#10099141</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Ergänzung</td><td>Gibco</td><td>Katze#35050061</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 9</td><td>GraphPad-Software</td><td>https://www.graphpad.com/</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>Nationale Sammlung authentifizierter Zellkulturen</td><td>#CSTR:19375.09.3101HUMSCSP510&nbsp; http://www.cellbank.org.cn/</td><td></td></tr><tr><td>Tauchöl Typ 37</td><td>Cargille Laboratorien</td><td>Katze #16237</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kat#I5500-50MG</td><td>Warm auf 37 °; C vor dem Gebrauch</td></tr><tr><td>LB Brühe (1x)</td><td>Invitrogen</td><td>Kat#10855001</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>Gibco</td><td>Katze#11095080</td><td>Warm auf 37 °; C vor dem Gebrauch</td></tr><tr><td>mySPIN 12&nbsp; Mini-Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Eins</td><td>Thermo Scientific</td><td>https://www.thermofisher.com</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Plan Fluor 40&times;/1.30 Öl Objektiv</td><td>Nikon</td><td>https://www.nikon.com/</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elemente-AR</td><td>Nikon</td><td>https://www.nikon.com/</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA) (100x)</td><td>Gibco</td><td>Kat#11140050</td><td></td></tr><tr><td>One Shot LB Agar Platten&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Kat#A55802</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 chemisch kompetent E.&nbsp; Coli</td><td>Invitrogen</td><td>Katze#C737303</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM</td><td>Katze#B8R05606</td><td></td></tr><tr><td>PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)</td><td>Gibco</td><td>Katze#10010023</td><td></td></tr><tr><td>pEevee-iAkt-NES (7.033&nbsp; bp)</td><td>Miura et&nbsp; al31</td><td>https://benchling.com/s/seq-q46zFYCfl0swLAun0t28/edit</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>Katze#15070063</td><td></td></tr><tr><td>Prophylaktische Plasmocin-Prophylaxe</td><td>InvivoGen</td><td>Kat#Ameise-MPP</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysin-Hydrobromid&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kat#P4832</td><td></td></tr><tr><td>Präzisions-Allzweckbadewannen</td><td>Thermo Scientific</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Bausatz</td><td>QIAGEN</td><td>Kat#27106</td><td></td></tr><tr><td>SnapGene (Englisch)</td><td>SnapGene von Dotmatics</td><td>https://www.snapgene.com</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>Katze#11360070</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenvorsatz-Filtereinheit, 0,22&nbsp; &mu; m</td><td>Millipore</td><td>Katze#SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Tokai Hit Inkubator auf der Bühne</td><td>TOKAI HIT</td><td>https://www.tokaihit-livecell.com/stagetopincubator</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-freies destilliertes Wasser</td><td>Invitrogen</td><td>Kat#10977015</td><td></td></tr><tr><td>Xfect Transfektionsreagenz</td><td>Takara Bio</td><td>Katze#631317</td><td></td></tr></tbody></table>

lebendzell-förster-resonanz-energietransfer-bildgebung der metabolisch regulierten akt-aktivierungsdynamik in hepg2-zellen

Live-Cell F&#246;rster Resonance Energy Transfer Imaging of Metabolically Regulated Akt Activation Dynamics in HepG2 Cells

Um die Akt-Aktivierung in HepG2-Zellen zu untersuchen, wurden die Zellen auf vorbeschichtete Bildgebungsschalen ausgesät und mit dem FRET-basierten Biosensor pEevee-iAkt-NES transfiziert (Abbildung 2A), der eine Echtzeitüberwachung der Akt-Phosphorylierung ermöglicht. Nach der Transfektion wurden die Zellen 4 Stunden lang in einem serumfreien Medium gehungert, um ihren Stoffwechselzustand zu synchronisieren und die Basalinsulinsignalisierung zu minimieren.
Die Zel...

Lebendzell-Förster-Resonanz-Energietransfer-Bildgebung der metabolisch regulierten Akt-Aktivierungsdynamik in HepG2-Zellen

Metabolically regulated Akt activation is a critical node in the insulin signaling cascade and provides valuable insights into the relationship between ...

Die zelluläre Heterogenität ist ein Hindernis für die genaue Beschreibung der Feinheiten der zellulären Dynamik, die im Wesentlichen herausgemittelt werden. Deshalb sind wir hier, um einzelne Zellen abzubilden. Jüngste Entwicklungen bei genetisch kodierten FRET-Biosensoren haben die Spezifität verbessert und die Echtzeit-Verfolgung von Akt innerhalb von Zellen revolutioniert, was für das Verständnis der Heterogenetik und die Entwicklung personalisierter Arzneimitteltherapien von entscheidender Bedeutung ist.Krebs und Diabetes durchlaufen komplexe Stoffwechselwege. Um die Biokomplexität des Insulin-Signalwegs bei Krebs zu entschlüsseln, verwenden wir modernste Lebendzell-FRET-Bildgebung mit Einzelzellauflösung. Wir haben festgestellt, dass die Optimierung der konfokalen Mikroskop-, Hardware- und Softwarekonfiguration sowie die Feinabstimmung der Laserleistung und die Anpassung der Detektorverstärkung entscheidend sind, um Rauschen und spektrales Übersprechen in FRET-Signalen zu minimieren.Traditionellen Bulk-Methoden wie Western Blotting fehlen räumliche, zeitliche Details und maskieren die zelluläre Heterogenität. Unser Protokoll füllt diese Lücke, indem es FRET-Bildgebung mit lebenden Zellen verwendet, um die zelluläre Reaktion mit hoher Präzision und Genauigkeit zu erfassen. Geben Sie zunächst einen Milliliter einer Poly-L-Lysin-Lösung von 0,1 Milligramm pro Milliliter in eine Bildgebungsschale und schütteln Sie die Schale, um die gesamte Oberfläche zu bedecken.Nach der Inkubation über Nacht die überschüssige Poly-L-Lysin-Lösung aus der Schale aspirieren. Spülen Sie die Oberfläche 3 Mal vorsichtig mit PBS ab und ruhen Sie jeweils fünf Minuten, um das ungebundene Poly-L-Lysin vollständig zu entfernen. Aspirieren Sie das PBS und trocknen Sie die beschichtete Bildgebungsschüssel mindestens drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius an der Luft.Als nächstes säen Sie die HepG2-Zellen 24 bis 48 Stunden vor der Transfektion in die vorbeschichtete Bildgebungsschale, um sicherzustellen, dass sie eine Konfluenz von 70 bis 90 % erreichen. Tauen Sie das Transfektionsreagenz zusammen mit dem Plasmid, das für den Forster-Resonanz-Energietransfer-Biosensor kodiert, auf und wirbeln Sie es vor. Führen Sie eine kurze Drehung durch, um die gesamte Mischung am Boden des Rohrs aufzufangen.Mischen Sie acht Mikrogramm des Plasmids mit dem Reaktionspuffer unter Verwendung eines Wirbels fünf Sekunden lang bei hoher Geschwindigkeit zu einem Endvolumen von 100 Mikrolitern. Führen Sie eine kurze Drehung durch, um die Mischung am Boden des Rohrs aufzufangen. Geben Sie 2,4 Mikroliter des Transfektionspolymers in das Röhrchen mit der verdünnten Plasma-DNA und mischen Sie es gut.Inkubieren Sie das Biosensor-Polymer-Gemisch 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, damit sich Nanopartikelkomplexe bilden können. Drehen Sie das Röhrchen fünf Sekunden lang bei 5.000 g nach unten, um den Inhalt am Boden aufzufangen. Geben Sie die gesamten 100 Mikroliter der Nanopartikel-Komplexlösung tropfenweise in das Zellkulturmedium und schütteln Sie die Platte vorsichtig hin und her, um sie zu mischen.Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für vier Stunden bis über Nacht. Nachdem Sie die Nanopartikelkomplexe aus den Zellen entfernt haben, ersetzen Sie die Lösung durch zwei Milliliter frisches vollständiges Wachstumsmedium. Stellen Sie die Platte bis zum Zeitpunkt der Analyse wieder in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator.Analysieren Sie die Zellen unter Fluoreszenzmikroskopie. Nehmen Sie das Kulturmedium aus der Bildgebungsschale und spülen Sie die Schale zweimal mit 1X PBS aus, wobei jede Spülung fünf Minuten lang dauert. Gib zwei Milliliter Hungermedium in jede Schale am Rand der Schale.Inkubieren Sie die Zellen vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Schalten Sie anschließend den Computer ein und schalten Sie dann nacheinander das Hauptgerät und das Zubehör des Konfokalmikroskops ein. Aktivieren Sie danach das Lasersystem, indem Sie den Schlüssel in die Ein-Position drehen und die Kippschalter für den Laserstart umlegen.Drehen Sie dann die Laser-Lock-Schalter im Uhrzeigersinn in die Ein-Position für beide Laserlinien. Schalten Sie abschließend den Systemcontroller ein. Starten Sie die AR-Software NIS-Elements vom Desktop aus.Klicken Sie auf A1 für Erfassung, um die Bildgebungseinrichtung zu starten und die geeigneten optischen Konfigurationen basierend auf den experimentellen Anforderungen auszuwählen. Installieren Sie den Inkubator für den Mikroskoptisch und befestigen Sie ihn mit Schrauben. Füllen Sie das innere Wasserbad mit sterilem, doppelt destilliertem Wasser.Installieren Sie dann die obere Heizung und schalten Sie die Stromversorgung für die Bühnenheizung, die Badheizung und die Linsenheizung ein. Wischen Sie die 40X-Öl-Immersionslinse mit Linsenpapier ab, das mit 95 % Ethanol angefeuchtet ist, und geben Sie ein kleines Tröpfchen Immersionsöl auf die Objektivlinse. Positionieren Sie dann die Bildgebungsschale mit den HepG2-Zellen auf dem Mikroskoptisch und befestigen Sie sie mit der Halterung.Schließen Sie die Kammer und inkubieren Sie die Zellen ein bis zwei Stunden lang, um eine Äquilibrierung zu ermöglichen. Starten Sie das ND-Aufnahmefenster über das Menü Datei des NIS-Elements AR. Wählen Sie die Registerkarte Zeit aus, um das Intervall, die Dauer und die Schleifen für das Zeitraffer-Imaging festzulegen. Klicken Sie auf die Registerkarte XY und klicken Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen, um HepG2-Zellen für die Bildgebung in den Fokus aufzunehmen.Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen Z, um die Z-Position festzulegen. Klicken Sie auf Durchsuchen, um einen Zielordner auszuwählen. Geben Sie den Namen des Experiments in das Feld Dateiname ein.Klicken Sie auf Jetzt ausführen, um die Erfassung zu starten und den Zeitraffer-Imaging-Prozess zu starten. Zeichnen Sie Ausgangswerte bis zu 30 Minuten lang ohne insulinhaltige Medien auf. Pausieren Sie die Bildgebung in regelmäßigen Abständen.Nehmen Sie das Medium vorsichtig aus der Glasbodenschale und fügen Sie einen Milliliter Medium hinzu, das mit der entsprechenden Insulinkonzentration versetzt ist. Setzen Sie die Bildaufnahme fort und klicken Sie am Ende des Experiments auf Fertig stellen, um es zu schließen. Sichern und speichern Sie schließlich die erfassten Bilder für die Analyse.Nach Insulinstimulation wurde ein dosisabhängiger Anstieg der Akt-Phosphorylierung beobachtet, wobei ein starker Anstieg bei 300 picomolarem Insulin auftrat. Jenseits dieser Konzentration stagnierten die Phosphorylierungsniveaus und sanken auch nach einer Insulinsenkung nicht. Das normalisierte FRET-Verhältnis zeigte einen ähnlichen Trend, mit einem zunehmenden Signal bei Insulinstimulation und einem Versagen bei der Rückkehr zum Ausgangswert nach Insulinentzug.Bei sequentieller Insulinstimulation wurde ein progressiver Anstieg des normalisierten FRET-Verhältnisses beobachtet, was die dosisabhängige Akt-Aktivierungsreaktion unterstützt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

FRET-basierten Reporter werden immer häufiger eingesetzt, um Kinase-und Phosphatase-Aktivitäten in lebenden Zellen zu überwachen. Hier beschreiben wir eine Methode auf, wie FRET-basierten Reporter nutzen, um den Zellzyklus-abhängige Veränderungen in Ziel-Phosphorylierung zu beurteilen.

Überwachung Kinase und Phosphatase-Aktivitäten durch den Zellzyklus durch Ratiometric FRET

Leucin-reichen Repeat-Kinasen 1 und 2 (LRRK1 und LRRK2) sind Multidomänen-Proteine, die sowohl GTPase und Kinase-Domänen kodieren, und die in Zellen phosphoryliert sind. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur LRRK1 und LRRK2 in Zellen mit 32 P-Orthophosphat zu kennzeichnen, wodurch ein Mittel, um ihre Gesamtzell Phosphorylierung zu messen bietet.

Metabolische Markierung von Leucin Rich-Repeat-Kinasen 1 und 2 mit radioaktivem Phosphat

MRP4- regelt verschiedene zyklische Nukleotid-abhängige Signalereignisse einschließlich einer kürzlich aufgeklärte Rolle bei der Zellmigration. Wir beschreiben eine direkte, aber vielschichtigen Ansatz, um die nachgelagerten molekularen Targets von MRP4- zu entwirren bei der Identifizierung eines einzigartigen MRP4- Interaktom führt, die Schlüsselrollen in der fein abgestimmten Regulierung der Fibroblasten-Migration spielt.

Methoden zur Untersuchung MRP4- haltigen Makromolekulare Komplexe in der Verordnung von Fibroblast Migration

Hier präsentieren wir ein Protokoll zu Bild-Zellen, die das grün fluoreszierende Protein-markierten Angiotensin Typ 1a-Rezeptoren während der Endozytose durch Angiotensin-II-Behandlung eingeleitet werden. Diese Technik beinhaltet die Kennzeichnung Lysosomen mit einem zweiten Fluoreszenzmarker, und dann Software die Co-Lokalisierung des Rezeptors und Lysosom in drei Dimensionen über die Zeit zu analysieren, verwendet.

Live Cell Imaging und 3D-Analyse von Angiotensin-Rezeptor-Typ 1a Handel Transfizierte humane embryonale Nierenzellen mittels konfokaler Mikroskopie

Der eng fokussierte Femtosekundenlaser kann eine präzise Stimulation der Zellen ermöglichen, indem er in eine konfokale Mikroskopie gekoppelt wird, die die Echtzeitbeobachtung und Photostimulation ermöglicht. Die Photostimulation kann zellmolekulare Ereignisse wie ERK-Signalweg und mitochondriale Blitze reaktiver Sauerstoffspezies aktivieren.

Photostimulation durch Femtosecond Laser aktiviert extrazellulär-signalregulierte Kinase (ERK) Signalisierung oder Mitochondrienereignisse in Zielzellen

Hämatopoetische Stammvorläuferzellen (HSPCs) übergehen von einem Ruhezustand in einen Differenzierungszustand aufgrund ihrer metabolischen Plastizität während der Blutbildung. Hier stellen wir eine optimierte Methode zur Messung der mitochondrialen Atmung und Glykolyse von HSPCs vor.

Analyse des hämatopoetischen Stamm-Vorläufer-Zellstoffwechsels

Zeitaufgelöste Förster-Resonanzenergietransfer-Zell-basierte Assay-Protokolle werden für die einfache, spezifische, sensitive und robuste Quantifizierung von endogenen phosphorylierten Signalwandlern und Aktivatoren der Transkription (STAT) 1/3/4/5/6-Proteinen in Zelllysaten im 384-Well-Format beschrieben.

Zeitaufgelöste Förster-Resonanz-Energietransfer-Assays zur Messung von endogenen phosphorylierten STAT-Proteinen in menschlichen Zellen

Der Echtzeit-Zellstoffwechselfluss-Assay misst die Sauerstoffverbrauchsrate und die extrazelluläre Säuerungsrate, die der mitochondrialen und glykolytischen Adenosintriphosphatproduktion entspricht, unter Verwendung von pH- und Sauerstoffsensoren. Das Manuskript erklärt eine Methode zum Verständnis des Energiestatus von Osteoblasten und die Charakterisierung und Interpretation des zellulären bioenergetischen Status.

Verwendung eines Echtzeit-Zellstoffwechselflussanalysators zur Überwachung der Bioenergetik des Osteoblast

Dieses Protokoll beschreibt die Fluoreszenzbildgebung und Analyse der endogenen metabolischen Coenzyme, des reduzierten Nicotinamidadenins (Phosphat) -Dinukleotids (NAD (P) H) und des oxidierten Flavinadenindinukleotids (FAD). Die Autofluoreszenzbildgebung von NAD(P)H und FAD bietet eine markierungsfreie, zerstörungsfreie Methode zur Beurteilung des Zellstoffwechsels.

Autofluoreszenzbildgebung zur Beurteilung des Zellstoffwechsels

Wir stellen ein Protokoll vor, um metabolische Aktivitäten in Zellen, die durch Aminosäuren reguliert werden, direkt sichtbar zu machen, indem wir Deuteriumoxid (schweres Wasser D2O) mit sondierter stimulierter Raman-Streuung (DO-SRS) verwenden, die in die Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenzmikroskopie (2PEF) integriert ist.

Bioorthogonale chemische Bildgebung des Zellstoffwechsels, der durch aromatische Aminosäuren reguliert wird

Dieses Protokoll integriert ein speziell angefertigtes Bioreaktorsystem mit hyperpolarisierter ¹³C-NMR-Spektroskopie zur Messung des Pyruvatstoffwechsels in lebenden Zellen in Echtzeit und verbessert so die Reproduzierbarkeit und kinetische Genauigkeit für Stoffwechselstudien und Wirkstoffscreening-Anwendungen.

Echtzeit-Stoffwechselnachweis in lebenden Zellen mittels hyperpolarisierter 13C NMR

Erfahren Sie die FRET-Bildgebung zur Analyse der Akt-Aktivierungsdynamik in lebenden HepG2-Zellen. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Einblicke in Insulinsignalwege und metabolische Regulation bei Leberkrebs.

Lebendzell-Förster-Resonanz-Energietransfer-Bildgebung der metabolisch regulierten Akt-Aktivierungsdynamik in HepG2-Zellen

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