Generierung und Charakterisierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Astrozyten, denen das fragile X-Boten-Ribonukleoprotein fehlt

Diese Arbeit konzentriert sich auf vier gehirnspezifische menschliche Astrozyten und wie sie durch neurologische Entwicklungsstörungen wie das Fragile-X-Syndrom verändert werden. Frühere Arbeiten verwendeten Tiermodelle, um hauptsächlich Neuronen zu untersuchen, so dass diese Arbeit diesem Forschungsbereich eine neue Dimension hinzufügt.

Mechanistische Erkenntnisse aus Tierversuchen waren klinisch nur begrenzt erfolgreich. Die große Herausforderung besteht darin, ähnliche Einblicke in Neuronen und Astrozyten menschlichen Ursprungs zu gewinnen.

Unser Protokoll hat erfolgreich funktionelle für windspezifische Astrozyten generiert, die beim Fragile-X-Syndrom einen dysregulierten, glykolytischen und mitochondrialen Stoffwechsel aufweisen, was Untersuchungen zur Rolle von Gliazellen in der Krankheitsbiologie ermöglicht. Trotz wachsender Beweise für die Schlüsselrolle der Gliazellen für die neuronale Funktion bei Gesundheit und Krankheit ist wenig darüber bekannt, wie menschliche Astrozyten bei neurologischen Entwicklungsstörungen wie dem Fragile-X-Syndrom beeinflusst werden.

Mit Blick auf die Zukunft werden wir auf diesem Rahmen aufbauen, um zu untersuchen, wie Astrozyten und ihre Interaktionen mit Neuronen durch Krankheiten verändert werden und wie diese dann durch therapeutische Interventionen korrigiert werden können.

[Dozent] Beschichten Sie zunächst eine Sechs-Well-Schale mit Matrigel, das im Verhältnis von eins bis 60 in fortgeschrittenem DMMF 12 verdünnt ist. Lagern Sie die beschichtete Form bei einer Temperatur von zwei bis acht Grad Celsius. Am Tag der Kultivierung entfernen Sie das Beschichtungsmaterial von der Schale und fügen Sie einen Milliliter des vollständigen essentiellen Acht-Mediums zusammen mit einem Gesteinsinhibitor in einer Endkonzentration von einem X hinzu. Stellen Sie die Schale in einen Inkubator. Bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid eingestellt, bevor die humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (IPSCs) hinzugefügt werden. Die humanen IPSCs werden in einem vollständigen essentiellen Medium mit acht Stoffen mit dem Gesteinsinhibitor in einer Endkonzentration von einem X ausgesät, um die Adhärenz der Kolonie zu verbessern. Ersetzen Sie am nächsten Tag das komplette essentielle achtfache Medium durch frisches Medium, dem der Gesteinsinhibitor fehlt. Füllen Sie das Medium täglich wieder auf, bis die Zellen 80 % Konfluenz erreicht haben, was etwa vier bis fünf Tage dauert. Wenn die Kolonien eine Konfluenz von 80 % erreichen, fügen Sie eine Mischung aus Kollagenase und Dispase hinzu, um sie enzymatisch von der Schale zu lösen. Sobald sich die Kolonien zu heben beginnen, nehmen Sie die Schale aus dem Inkubator und fügen Sie zwei Milliliter DPBS hinzu, um die Enzymaktivität zu neutralisieren. Kratzen Sie mit DPBS die Kolonien ab und sammeln Sie die Suspension in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen mit einer serologischen 10-Liter-Pipette aus breitem Brett. Dann zerkleinern Sie die Suspension mit einer 10-Milliliter-Serologiepipette zwei- bis dreimal vorsichtig, um die Kolonien aufzubrechen. Lassen Sie die Völker sich ansiedeln. Nach etwa zwei Minuten aspirieren Sie das DPBS-Enzymgemisch, während Sie etwa einen Milliliter Flüssigkeit im Röhrchen belassen. Geben Sie dann zwei Milliliter DPBS in das Röhrchen und mischen Sie durch leichtes Klopfen, um die Kolonien wieder zu suspendieren. Lassen Sie sie sich absetzen und wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal, um das restliche Enzym zu entfernen. Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, suspendieren Sie die Kolonien wieder in einem Milliliter des vollständigen essentiellen Acht-Mediums und geben Sie sie in eine frisch zubereitete Matrigel-beschichtete Schale. Heben Sie die humanen induzierten pluripotenten Stammzellen enzymatisch an, wie zuvor beschrieben. Plattieren Sie sie auf eine nicht haftende 100-Millimeter-Suspensionskulturschale mit chemisch definiertem Medium. Legen Sie die Zellsuspension sieben Tage lang unter normoxischen Bedingungen bei 40 Umdrehungen pro Minute auf einen Orbitalschüttler, um die Entwicklung von Corticosphären zu erleichtern. Übertragen Sie die Cortico-Kugeln am achten Tag in ein Zellproliferationsmedium und halten Sie sie sieben Tage lang aufrecht. Um die Gliaspezifikation zu induzieren, inkubieren Sie die Corticosphären zwei Wochen lang in Gliaanreicherungsmedium, um frühe Gliasphären zu erhalten. Für die Reifung der frühen Gliasphären ersetzen Sie den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor H durch 20 Nanogramm pro Milliliter Leukämie-Hemmfaktor und halten Sie die Kugeln vier Wochen lang.

Nach vier Wochen im Reifungsmedium halten Sie die Kugeln über einen längeren Zeitraum im Gliaanreicherungsmedium. Um eine Aggregation und einen Verlust der Lebensfähigkeit zu vermeiden, hacken Sie die Gliakugeln alle zwei Wochen mechanisch mit einer sterilen Industrieklinge. Ersetzen Sie das gesamte Medium durch DNase One, um DNA-Fragmente zu entfernen, die beim Zerkleinern anfallen. Als nächstes dissoziieren Sie die Gliasphären in Monoschichten von Astrozyten-Vorläuferzellen mit einem Papain-Dissoziationskit. Die dissoziierten Zellen werden auf eine Zellkultur-, behandelte adhärente Schale aufgebracht, die mit Matrigel in einer Verdünnung von eins bis 80 vorbeschichtet ist. Vermehren Sie die Astrozyten-Vorläuferzellen in Glia-Anreicherungsmedium, bis sie eine Konfluenz von 80 % erreichen. Durch den Durchgang der Zellen wird das verbrauchte Medium entfernt und in einem konischen Röhrchen gesammelt. Geben Sie den Zellen ein Enzymzellablösungsmedium hinzu und warten Sie ein bis zwei Minuten. Sobald sich die Zellen abzulösen beginnen, fügen Sie das verbrauchte Medium hinzu, um die Enzymaktivität zu neutralisieren. Die Zellsuspension auffangen und zwei Minuten lang bei 800 g zentrifugieren. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, suspendieren Sie die Zellen wieder in Gliaanreicherungsmedium. Etwa eins mal 10 hoch sechs Zellen pro Vertiefung auf eine mit Matrigel beschichtete Schale in einer Verdünnung von eins bis 80 auffüllen. Für die Kryokonservierung resuspendieren Sie das Zellpellet in einer kalten Mischung aus 90 % Corticosphären-Proliferationsmedium und 10 % Kryoprotektivum. Übertragen Sie die resuspendierten Zellen in Kryofläschchen. Setzen Sie die Kryo-Fläschchen sofort in eine Kryobox um und lagern Sie sie über Nacht bei minus 80 Grad Celsius im Gefrierschrank. Füllen Sie am nächsten Tag alle Kryo-Fläschchen zur Langzeitlagerung in einen Flüssigstickstofftank um. Charakterisierung der dissoziierten Astrozyten-Vorläuferzellen durch Immunfärbung mit Vimenton und Kernfaktor-IAM-Markern. Um die regionale Spezifität der vier Gehirne von humanen IPSC-abgeleiteten APCs zu bestätigen, führen Sie eine Echtzeit-QPCR-Analyse für die humane Gabelkopfbox G1 und die humane Homöobox B4 durch. Differenzieren Sie APCs 14 Tage lang in Astrozyten und astrozytäres Differenzierungsmedium. Plattieren Sie Astrozyten auf einer 35 Millimeter großen Glasbodenschale mit einer Dichte von fünfmal 10 hoch drei Zellen pro Schale, um ihre Reaktion auf Adenosin-Fünf-Tri-Phosphat zu messen. Lassen Sie die Zellen 24 Stunden lang am Glasboden haften. Waschen Sie die anhaftenden Zellen dreimal mit Hank's Balanced Salt Solution ohne Kalzium. Inkubieren Sie dann die Zellen in dem Kulturmedium mit fünf mikromolaren Verhältnissen, Diureid 2:00 AM und 0,02 % pluronic F127 für eine Stunde bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die Zellen zweimal mit Kulturmedium gewaschen haben, ersetzen Sie das Medium durch zwei millimolare Kalziumquellen, die Hank's Balanced Salt-Lösung enthalten. Bilden Sie die Zellen mit zwei Bildern pro Sekunde ab, indem Sie ein 60-faches Öl-Immersionsobjektiv an einem fokussierten, driftkompensierenden inversen Mikroskop verwenden. Zeichnen Sie schließlich ATP-induzierte Kalziumreaktionen nach Zugabe von ATP in einer Endkonzentration von fünf Millimolar bei der 25-Sekunden-Marke auf. Humane IPSC-Kolonien exprimierten pluripotente Marker opt four und nano, wie durch Immunfärbung bestätigt wurde. APCs, die aus dem Fragile-X-Syndrom und Kontrolllinien abgeleitet wurden, zeigten vergleichbare Anteile von Vimentin und NFIA-positiven Zellen. Astrozyten-Vorläuferzellen sowohl aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen als auch aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen mit Fragile-X-Syndrom zeigten eine Hochregulation von Fox G1 im Vergleich zu HOXB4, was auf eine Identität des Vorderhirns hinweist. Astrozyten, die aus humanen IPSC-Linien des fragilen X-Syndroms stammen, zeigten eine reduzierte Anzahl von GFAP-Expressionen. Kontroll- und Fragile-X-Syndrom-Astrozyten wiesen ATP-induzierte Kalziumtransienten auf, aber die Anzahl der Responder war bei Fragile-X-Syndrom-Astrozyten signifikant niedriger. Die maximale Amplitude des ersten ATP-evozierten Calciumtransienten war in Astrozyten des fragilen X-Syndroms im Vergleich zu den Kontrollzellen signifikant niedriger. Humane IPSC-abgeleitete Astrozyten des fragilen X-Syndroms zeigten eine Zunahme der Glykolyse, der glykolytischen Kapazität und der glykolytischen Reserven, zeigten aber eine signifikante Abnahme der maximalen Atmung im Vergleich zu Kontrollastrozyten.