Name: CRISPR-Epigenom-Editierung in menschlichen Zellen mittels Plasmid-DNA-Transfektion und mRNA-Nukleofektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Erfahren Sie CRISPR-Epigenom-Editierung in menschlichen Zellen mittels Plasmid-DNA-Transfektion und mRNA-Nukleofektion. Diese Methode ermöglicht gezielte Genmodulation ohne DNA-Brüche.

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Obwohl der genomische Gehalt jeder Zelle in unserem Körper nahezu identisch ist, unterscheidet sich das Transkriptionsprofil der einzelnen Zelltypen stark. Epigenetische Modifikationen an DNA- und Histonproteinen sind Schlüsselregulatoren der transkriptionellen Expression. Transkriptionell aktives Euchromatin zeichnet sich durch ausgeprägte epigenetische Markierungen im Vergleich zu kompaktem, transkriptionell inaktivem Heterochromatin aus. Zum Beispiel werden heterochromatische Regionen durch repressive Histonmodifikationen definiert, einschließlich Trimethylierung an Lysin 9 von Histon 3 (H3K9me3), Trimethylierung an Lysin 27 von Histon H3 (H3K27me3) und DNA-Methylierung an Cytosinen neben Guaninen (CpG) an Genpromotoren1. Genomische Regionen der aktiven Genexpression werden typischerweise durch Histonacetylierung und Trimethylierung an Lysin 4 von Histon 3 (H3K4me3)1 definiert.
Die CRISPR-Revolution (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) hat eine Fülle von Werkzeugen hervorgebracht, die eine programmierte Veränderung genomischer Sequenzen ermöglichen. Die CRISPR-Technologie basiert auf einem prokaryotischen Abwehrmechanismus, der in der Lage ist, Nukleinsäuren an programmierbaren Zielsequenzen zu spalten. Die CRISPR-Nukleasen 2,3,4, die Baseneditoren 5,6 und die Prime-Editoren 7,8 können die DNA-Sequenz von Säugetiergenomen durch DNA-Schnitt und Reparatur dieser Brüche verändern. Obwohl diese Strategien effektiv sind, können sie DNA-Brüche an Off-Target-Stellen 9,10 und großflächige genomische Strukturmutationenverursachen 11,12,13,14,15. Alternative CRISPR-basierte Werkzeuge ermöglichen eine steuerbare Modulation der Genaktivierung und -repression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern. Diese Werkzeuge nutzen ein Nuklease-defizientes Cas9 (dCas9), das eine DNA-Bindung an Zielstellen ermöglicht, die von der sgRNA-Sequenz vorgegeben werden, in Kombination mit Effektorproteinen, die die Chromatinlandschaft verändern 16,17,18. Effektorproteine, wie epigenetische Schreiber, Reader und Radiergummis, können direkt mit dCas9 fusioniert oder durch ein mit dCas9 fusioniertes Peptidgerüst wie SunTag oder ein RNA-Gerüst auf der sgRNA, wie das MS2-MCP-System 16,17,18, rekrutiert werden. Beispiele für programmierbare Transkriptionskontrollwerkzeuge sind die CRISPR-Aktivierung (CRISPRa)19,20,21 und die CRISPR-Interferenz (CRISPRi)22,23. CRISPRa funktioniert, indem es die Transkriptionsmaschinerie direkt rekrutiert und so die Transkriptionsgenexpression des Ziels erhöht19. Im Gegensatz dazu unterdrückt CRISPRi die Transkription, indem es H3K9me3, eine repressive epigenetische Markierung, etabliert22.
Fortschritte in der Epigenom-Editierung haben einen breiten Einsatz dieser Werkzeuge in allen wissenschaftlichen Bereichen ermöglicht. Fusionen verschiedener Effektordomänen und Proteine haben das Toolkit der verfügbaren Epigenom-Editorenerweitert 18,24,25,26,27,28,29,30. Darüber hinaus werden Epigenom-Editoren verwendet, um die Rolle von epigenetischen Modifikationen 31,32,33,34,35,36, Effektoren 37,38,39 und Effektormutationen 28,40,41 zu entschlüsseln in der Genregulation. Insbesondere werden CRISPRi und CRISPRa in funktionellen Genomik-Screenings für eine Vielzahl biologischer Prozesse verwendet, einschließlich des Zellüberlebens42 und des Zellschicksals 43,44,45,46,47. Darüber hinaus birgt die Epigenom-Editierung therapeutisches Potenzial für ex vivo Cell Engineering und in vivo Therapien18.
Hier beschreiben wir Methoden zur Anwendung von zwei dCas9-basierten Epigenom-Editoren für die programmierbare transkriptionelle Repression in humanen Zelllinien: CRISPRi22 und CRISPRoff48. CRISPRi ist eine Fusion von dCas9 mit der repressiven KRAB-Domäne aus einem Zinkfingerprotein wie ZNF10 (KOX1) und ZIM322,23. Wenn CRISPRi auf einen bestimmten Genpromotor abzielt, rekrutiert die KRAB-Domäne einen H3K9me3-Schreiber, SETDB1, um das Zielgen zu unterdrücken (Abbildung 1A). Wenn CRISPRi transient exprimiert wird, wird das etablierte H3K9me3 am Ziellocus nicht aufrechterhalten und die Genexpression wird im Laufe der Zeit wiederhergestellt32,48. Um stabile Knockdowns mit CRISPRi durchzuführen, z. B. in der funktionellen Genomik, ist die konstitutive Expression von CRISPRi in den Zellen zusammen mit der sgRNA unerlässlich. Vor kurzem wurde CRISPRoff entwickelt, um die Bearbeitung von vererbbaren Epigenomen zu programmieren48. CRISPRoff ist eine Einzelproteinfusion von dCas9 mit der KRAB-Domäne und dem de novo DNA-Methyltransferase-Komplex, DNMT3A und DNMT3L. Ein transienter Impuls von CRISPRoff in menschlichen Zellen programmiert die Ablagerung von H3K9me3 und die DNA-Methylierung an den Zielgenen, was zu einer langfristigen Repression der Zielgene durch die Aufrechterhaltung der DNA-Methylierung und von H3K9me3 führt (Abbildung 1B)48. Darüber hinaus können Epigenom-Bearbeitungen rückgängig gemacht werden. Zum Beispiel kann ein Gen, das durch CRISPRoff stabil zum Schweigen gebracht wird, durch TET1-dCas9 reaktiviert werden, das die DNA-Methylierungsmarkierungen an den Zielloci49 enzymatisch entfernen kann.
In diesem Protokoll werden zwei Verabreichungsmethoden für die transiente Expression von Epigenom-Editoren beschrieben: die Plasmid-DNA-Transfektion und die mRNA-Nukleofektion. Darüber hinaus skizzieren wir, wie die Durchflusszytometrie zur Beurteilung der Wirksamkeit der Epigenom-Editierung an zwei endogenen Genen, CLTA und CD55, verwendet werden kann. Diese Methoden können mit zusätzlichen Editoren angepasst und auf andere Epigenom-Editing-Experimente angewendet werden oder für das Targeting verschiedener Gene verwendet werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68089/68089fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Mechanismus und des Arbeitsablaufs der Epigenom-Editierung von CRISPRi und CRISPRoff. (A) Lineare Schemata des sgRNA-Transgens und des CRISPRi-Epigenom-Editors. Die Zugabe von CRISPRi und sgRNA ermöglicht die Zugabe der repressiven H3K9me3-Histonmarkierung, um den Ziellocus zum Schweigen zu bringen. Der höchste Grad an Silencing wird früh nach der CRISPRi-Zugabe erreicht, und das Genziel wird in der Regel nach einigen Passagen reaktiviert. (B) Lineare Schemata des sgRNA-Transgens und des CRISPRoff-Epigenom-Editors. Die Zugabe von CRISPRoff zu Zellen, die auf ein Gen von Interesse abzielen, führt zur Zugabe von repressivem H3K9me3 zusammen mit DNA-Methylierung an CpG-Stellen, um das Zielgen zum Schweigen zu bringen. Das Silencing durch CRISPRoff ist vererbbar - das hohe Silencing wird früh während der Transfektion erreicht und bleibt über mehrere Zellteilungen bestehen. (C) Überblick über den Zeitplan für die Epigenom-Editierung mittels Transfektionsmethode. Am Tag 0 werden die Zellen für die Transfektion plattiert. An Tag 1 kann das Editor- und Guide-Plasmid per Transfektion in die Zellen eingebracht werden. An Tag 3 werden die Zellen mittels Durchflusszytometrie auf BFP-Expression untersucht. Der Prozentsatz der BFP wird als Normalisierungsfaktor verwendet, um die endgültige Stummschaltungswirksamkeit des Experiments für jede Bedingung zu bestimmen. Ab Tag 6 werden die Zellen auf Stummschaltung des interessierenden Reporters analysiert, da an diesem Tag der höchste Grad an Stummschaltung erreicht wird. (D) Überblick über die Transfektionsmethode, wobei Epigenom-Editor und sgRNA-Plasmide den Zellen tropfenweise zugesetzt werden. (E) Überblick über den zeitlichen Ablauf der Epigenom-Editierung mit Hilfe der Nukleofektionsmethoden. In diesem Protokoll ist mRNA die Nukleofektion in die Zellen am Tag 0. Die Zellen werden am Tag 3 nach der Nukleofektion mittels Durchflusszytometrie auf Silencing untersucht. (F) Überblick über das Nukleofektionsprotokoll. Entsprechende Mengen an Zellen und mRNA werden gemischt und in Nukleofektorküvetten gegeben. Wird die sgRNA durch Nukleofektion eingebracht, kann sie auch zu diesem Gemisch hinzugefügt werden. Die Küvetten werden in den Nukleofektor gegeben, und geeignete Pulscodes werden verwendet, um die mRNA in die Zellen einzuführen. Nach der Nukleofektion werden die Zellen plattiert und für die Analyse in späteren Tagen durchgelassen. (G) Vergleich zwischen Plasmidtransfektion und mRNA-Nukleofektionsstrategien für die Epigenom-Editierung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68089/68089fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>AAF-1003</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Gewebekulturplatten</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-U-Bodenplatte</td><td>Corning</td><td>351177</td><td></td></tr><tr><td>APC Anti-Human-CD55-Antikörper</td><td>BioLegend</td><td>311312</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSymphony A1 Durchflusszytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Waxie</td><td></td><td></td>11003428432</tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5425</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automatisierter Zellzähler</td><td>Thermo Scientific</td><td>Countess 3</td><td></td></tr><tr><td>CRISPRoff Transfektionsplasmid</td><td>Addgen&nbsp;</td><td></td><td></td>167981</tr><tr><td>Diluent 2 Hämatologie-Reagenz für die Durchflusszytometrie (Scheidenflüssigkeit)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-029-361</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt</td><td>Thermo Scientific</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Röhrchen</td><td>Thomas scientific</td><td>1159M35</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Avantor Seradigm</td><td>89510-186</td><td></td></tr><tr><td>Lonza Walkersville&nbsp; SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit L</td><td>Fisher</td><td>Scientific NC0281111</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE&trade; T7 ULTRA Transkriptionskit</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Streifenröhrchen</td><td>USA Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>pLG1 sgRNA-Expressionsplasmid</td><td>Addgen&nbsp;</td><td></td><td></td>217306</tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>22-400-105</td><td></td></tr><tr><td>SF Zelllinie 96-Well-Nukleofektor&reg; &nbsp; Kit</td><td>Lonza</td><td>V4SC-2096</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekultur-Inkubator</td><td>PHCbi</td><td>MCO-170AICUVDL-PA</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-LTI Transfektionsreagenz</td><td>Mirus</td><td>MIR 2306</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200114</td><td></td></tr></tbody></table>

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CRISPR Epigenome Editing in Human Cells using Plasmid DNA Transfection and mRNA Nucleofection Delivery

Bei allen Epigenom-Editing-Experimenten sind geeignete Kontrollen entscheidend, um die Effizienz der Epigenom-Editierung zu bewerten. Wir empfehlen die Verwendung einer Kontroll-sgRNA, die auf keine Sequenz im menschlichen Genom abzielt. Die Verwendung einer Nicht-Targeting-Guide-Kontrolle gibt die Gewissheit, dass Änderungen an den Zielloci durch den Epigenom-Editor verursacht werden, der an diese Stelle geleitet wird, und nicht nur durch Überexpression oder unspezifische Bindung des Epigenom-Editors. Darüber hinaus emp...

CRISPR-Epigenom-Editierung in menschlichen Zellen mittels Plasmid-DNA-Transfektion und mRNA-Nukleofektion

Epigenetics refers to chemical modifications of histone proteins and DNA that can regulate the expression of genes. The human epigenome is altered ...

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