Überwachung der Konformationsdynamik einzelner unmodifizierter Proteine mit einer plasmonischen Nanopinzette

Diese Forschung zielt darauf ab, Einblicke in markierungsfreie Proteine auf Einzelmolekülebene in Echtzeit zu gewinnen, mit besonderem Fokus auf Proteine, die mit aktuellen Techniken nur schwer zu untersuchen sind oder für Krankheiten relevant sind. Plasmonische Nanopinzetten haben kürzlich ihre Fähigkeit unter Beweis gestellt, die Konformationsdynamik bei der Bindung an kleine Moleküle zu überwachen, die Zerlegungskinetik zu überprüfen und die Landschaft der freien Energie aufzuklären – und das alles auf Einzelmolekülebene. Derzeit ist keine etablierte Proteincharakterisierungstechnik in der Lage, die markierungsfreie Konformationsdynamik von Einzelmolekülproteinen zu untersuchen.

Es wird angenommen, dass plasmonische Nanopinzetten das Potenzial haben, diese Nische innerhalb des Feldes zu füllen. Dieser einzigartige Vorteil hilft uns, den Zusammenhang zwischen der Konformationsänderung von Proteinen und ihren biologischen Funktionen und den Auswirkungen auf die Krankheitsentstehung zu untersuchen. Zukünftige Forschungen werden sich auf intrinsisch ungeordnete Proteine und Membranproteine konzentrieren, da viele von ihnen an verschiedenen Krankheiten wie Alzheimer, Parkinson und verschiedenen Krebsarten beteiligt sind.

Legen Sie zunächst die mit PEG-Thiol beschichtete Probe mit einer geraden Pinzette in die 3D-gedruckte Durchflusszelle und stellen Sie sicher, dass die Goldschicht nach oben zeigt. Ziehen Sie eine Seite der doppelseitigen Klebebandabdeckung aus durchsichtigem PET-Kunststoff ab. Legen Sie das Klebeband vorsichtig über die Probe und die Durchflusszelle und stellen Sie sicher, dass die Nanostrukturen und Ein- und Auslasslöcher in der Durchflusszelle unbedeckt bleiben.

Drücken Sie mit einer abgerundeten Pinzette vorsichtig um die Ränder des Bandes, um seine Haftung an der Durchflusszelle und der Probe zu gewährleisten. Ziehen Sie die andere Seite des Klebebandes ab und legen Sie vorsichtig einen Glasabdeckzettel über die Probe. Drücken Sie mit einer abgerundeten Pinzette um die Ränder des Deckglases, um seine Haftung zu sichern.

Durch diesen Prozess entsteht innerhalb der Durchflusszelle ein Flüssigkeitskanal mit einer Höhe von 50 Mikrometern und einem Volumen von 3,5 Mikrolitern. Mischen Sie mit einer kleinen Pipettenspitze Lösung A und Lösung B des Dupliziersilikons zu gleichen Teilen im Verhältnis eins zu eins oder nach Herstellerangabe auf einen Objektträger. Füllen Sie die Lücken zwischen Deckglas und Durchflusszelle mit einem gemischten Dupliziersilikon und schieben Sie es vorsichtig unter den Deckglas.

Halten Sie die Durchflusszelle auf den Kopf und tragen Sie vorsichtig Dupliziersilikon um die Innenwand des Lochs auf. Bewegen Sie das Silikon vorsichtig auf die sichtbaren Ränder der Unterseite der Probe und lassen Sie die Probe mit der Goldschicht nach oben trocknen, bis das Dupliziersilikon vollständig ausgehärtet ist. Nachdem Sie überprüft haben, dass alle Komponenten ordnungsgemäß angeschlossen sind, laden Sie die Benutzeroberfläche des mikrofluidischen Systems auf den Computer.

Klicken Sie auf das Play-Symbol neben dem MUX-Verteiler und dem Kabel, die das 12-mal-Ein-Zellenrad-Ventil bzw. das Drei-mal-Zwei-Wege-Ventil steuern, um die entsprechenden Schnittstellen zu öffnen. Um das Drei-mal-Zweiwege-Ventil zu umgehen, drehen Sie den ersten Anschluss des Kabels ein. Um die Durchflusszelle in eine plasmonische Nanopinzette zu montieren, befestigen Sie die Einlass- und Auslassrohre an den entsprechenden Teilen der Durchflusszelle.

Platzieren Sie die Durchflusszelle mit der Goldschicht nach oben auf sauberem Gewebe. Gießen Sie den Puffer mit einer hohen Durchflussrate von ca. 0,3 Millilitern pro Minute in die Durchflusszelle. Prüfen Sie, ob sich die Flüssigkeit über die Probe in der Durchflusszelle bewegt und dass weder an der Außen- noch an der Unterseite Flüssigkeit sichtbar ist.

Tragen Sie ein bis zwei Tropfen Immersionsöl auf das 100X-Objektiv auf. Platzieren Sie die Durchflusszelle mit der Goldschicht nach unten in den Tisch der plasmonischen Nanopinzette. Befestigen Sie die Durchflusszelle mit Metallklammern über den Magneten und verriegeln Sie den Tisch, um ihn an Ort und Stelle zu halten.

Schalten Sie die weiße Lichtquelle ein. Öffnen Sie die Kamerasoftware und passen Sie die Belichtungszeit und -verstärkung an, bis die Nanostrukturen sichtbar werden. Schalten Sie den Laser mit einer relativ hohen Leistung ein und stellen Sie die Z-Achse manuell ein, bis der Laserpunkt sichtbar ist.

Schalten Sie den piezoelektrischen Controller ein und wählen Sie die entsprechenden Einstellungen für den Kommunikationsanschluss und die maximale Spannung. Stellen Sie die Werte für die X-, Y- und Z-Achse auf die Hälfte der maximalen Spannung ein, um eine bessere Ausrichtung des Tisches in alle Richtungen zu ermöglichen. Richten Sie den Laserspot mit den Drehreglern der X-, Y- und Z-Achse der Hauptstufe an einer der Doppelnanoloch- oder DNH-Strukturen aus.

Stellen Sie sicher, dass die Lawinenfotodiode oder APD eingeschaltet ist. Schließen Sie das Gehäuse vorsichtig mit der plasmonischen Nanopinzette. Öffnen Sie die Software, die mit der APD-Aufzeichnung verknüpft ist, z. B. eine selbstgemachte LabVIEW-Benutzeroberfläche. Bearbeiten Sie den Dateinamen und legen Sie die Grenzfrequenz auf ein Kilohertz fest.

Geben Sie dann den gewünschten Dateipfad an, in dem die Dateien gespeichert werden sollen. Schalten Sie die weiße Lichtquelle aus und den Laser wieder ein. Nachdem Sie die Laserleistung auf einen geeigneten Pegel eingestellt haben, verwenden Sie die piezoelektrischen Steuerelemente, um die X-, Y- und Z-Achsen einzustellen, bis das APD-Signal so hoch wie möglich ist.

Vermeidung von APD-Sättigung und mit minimaler Standardabweichung der Spur. Schalten Sie anschließend den Laser aus, um die Lebensdauer der Nanostrukturen zu erhalten. Lassen Sie die Steuereinheit der Spritzenpumpe und die Benutzeroberfläche des Verteilers laufen, um das Ventil einzustellen und die gewünschte Proteinmenge zu entnehmen.

Infizieren Sie die Proteinlösung mit der mikrofluidischen Benutzeroberfläche mit einer Flussrate, die der Entnahmerate ähnelt. Setzen Sie die Infusion mit dieser Geschwindigkeit fort, bis die Proteinlösung die Durchflusszelle erreicht. Stellen Sie dann die Durchflussrate auf einen geeigneten Wert für das Überfüllen ein und warten Sie, bis die Leiterbahn stabilisiert ist.

Vergewissern Sie sich, dass das Volumen und die Zeit an der Spritzenpumpe mit den erwarteten Werten übereinstimmen. Um die APD-Signaldaten aufzuzeichnen, passen Sie die X-, Y- und Z-Achsen mithilfe der Benutzeroberfläche des piezoelektrischen Controllers nach Bedarf an. Wenn Sie eine große Änderung der Übertragung und der Standardabweichung beobachten, notieren Sie sich den Zeitpunkt, zu dem dies geschieht, für die zukünftige Datensortierung. Wenn das Protein im Rahmen des Experiments freigesetzt werden muss, schalten Sie den Laser für etwa fünf Sekunden aus und dann wieder ein.

Die Spur sollte eine große Änderung der Transmission und eine deutlich niedrigere Standardabweichung aufweisen, was auf eine Rückkehr zum Ausgangszustand hinweist. Schalten Sie nach Abschluss des Experiments den Laser aus. Entfernen Sie die Durchflusszelle aus dem dreiachsigen Tisch und trennen Sie die Schläuche des mikrofluidischen Systems.

Platzieren Sie die Durchflusszelle mit der Goldschicht nach oben auf sauberem Gewebe. Schneiden Sie mit einem Skalpell vorsichtig den Kleber unter dem Glasdeckel ab, bevor Sie ihn vorsichtig abheben und entsorgen. Halten Sie die Durchflusszelle schräg, wobei die Goldschicht immer noch nach oben zeigt, und entfernen Sie mit einer abgerundeten Pinzette vorsichtig den Kleber von der Unterseite der Durchflusszelle, um die Probe zu befreien.

Nehmen Sie die Probe mit einer geraden Pinzette auf und spülen Sie sie gründlich mit Isopropanol ab. Trocknen Sie die Probe mit einer Luftpistole. Ein repräsentatives Experiment, das an der in-situ-Eisenbeladung eines Apoferritin-Moleküls durchgeführt wurde, zeigt die Verwendung einer plasmonischen Nanopinzette als Werkzeug zur Untersuchung der Konformationsdynamik von Proteinen.

Die Transmissionsspur von Apoferritin bleibt stabil, wenn sie in einer PBS-Lösung gefangen ist, was auf keine signifikanten Konformationsänderungen hinweist. Bei Exposition gegenüber der eisenhaltigen Lösung nahmen die Schwankungen in den Standardabweichungen der Spur zu, was auf dynamische strukturelle Veränderungen im Zusammenhang mit der Eisenbelastung hinweist. Nach 20 Minuten Eisenexposition stabilisierte sich die Transmissionsspur, was auf den Übergang von Apoferritin zu seiner Holoform hinweist.

Die Diagramme der Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion zeigten eine Verschiebung der Spannungsverteilung bei Eisenbeladung, was den Konformationsübergang von Apoferritin zu Holoferritin weiter unterstützt.