Name: Überwachung der Konformationsdynamik einzelner unmodifizierter Proteine mit einer plasmonischen Nanopinzette (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Erfahren Sie, wie plasmonische Nanopinzetten die Konformationsdynamik einzelner unmodifizierter Proteine in Echtzeit überwachen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Proteinen, die für Alzheimer und Parkinson relevant sind.

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<ol><li>Peter Lu, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+up+single-molecule+enzymatic+conformational+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Sizing up single-molecule enzymatic conformational dynamics.</a> Chem Soc Rev. 43 (4), 1118-1143 (2014).</li>
<li>Mazal, H., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+methods+to+study+the+dynamics+of+proteins+at+work%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET methods to study the dynamics of proteins at work.</a> Curr Opin Biomed Eng. 12, 8-17 (2019).</li>
<li>Ritchie, D. B., Woodside, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+structural+dynamics+of+proteins+and+nucleic+acids+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing the structural dynamics of proteins and nucleic acids with optical tweezers.</a> Curr Opin Str Biol. 34, 43-51 (2015).</li>
<li>Neupane, K., Solanki, A., Sosova, I., Belov, M., Woodside, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+metastable+structures+formed+by+small+oligomers+of+%CE%B1-Synuclein+probed+by+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diverse metastable structures formed by small oligomers of α-Synuclein probed by force spectroscopy.</a> PLoS One. 9 (1), e86495(2014).</li>
<li>Hughes, M. L., Dougan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physics+of+pulling+polyproteins%3A+a+review+of+single+molecule+force+spectroscopy+using+the+AFM+to+study+protein+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Rep+Prog+Phys%22%5BJournal%5D)">The physics of pulling polyproteins: a review of single molecule force spectroscopy using the AFM to study protein unfolding.</a> Rep Prog Phys. 79 (7), 076601-076601 (2016).</li>
<li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li>
<li>Schmid, S., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopores%3A+a+versatile+tool+to+study+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nanopores: a versatile tool to study protein dynamics.</a> Essays Biochem. 65 (1), 93-107 (2021).</li>
<li>Van Meervelt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+conformational+changes+and+controlled+orientation+of+native+proteins+inside+a+protein+nanoreactor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Real-time conformational changes and controlled orientation of native proteins inside a protein nanoreactor.</a> J Am Chem Soc. 139 (51), 18640-18646 (2017).</li>
<li>Awasthi, S., Ying, C., Li, J., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+the+size+and+shape+of+single+%CE%B1-Synuclein+oligomers+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of the size and shape of single α-Synuclein oligomers in solution.</a> ACS Nano. 17 (13), 12325-12335 (2023).</li>
<li>Sµnchez-Rico, C., Von Vithenberg, L., Warner, L., Lamb, D. C., Sattler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fluorophore+attachment+on+protein+conformation+and+dynamics+studied+by+spFRET+and+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of fluorophore attachment on protein conformation and dynamics studied by spFRET and NMR spectroscopy.</a> Chemistry. 23 (57), 14267-14277 (2017).</li>
<li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+does+fluorescent+labeling+affect+the+binding+kinetics+of+proteins+with+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectr%22%5BJournal%5D)">How does fluorescent labeling affect the binding kinetics of proteins with intact cells.</a> Biosens Bioelectr. 66, 412-416 (2015).</li>
<li>Berkovich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+limit+of+protein+elastic+response+is+tether+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Rate limit of protein elastic response is tether dependent.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (36), 14416-14421 (2012).</li>
<li>Dahmardeh, M., Mirzaalian Dastjerdi, H., Mazal, H., Köstler, H., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-supervised+machine+learning+pushes+the+sensitivity+limit+in+label-free+detection+of+single+proteins+below+10+kDa%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Self-supervised machine learning pushes the sensitivity limit in label-free detection of single proteins below 10 kDa.</a> Nat Meth. 20 (3), 442-447 (2023).</li>
<li>Becker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+description+for+optical+mass+measurement+of+single+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Photon%22%5BJournal%5D)">A quantitative description for optical mass measurement of single biomolecules.</a> ACS Photon. 10 (8), 2699-2710 (2023).</li>
<li>Houghtaling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+shape%2C+volume%2C+and+dipole+moment+of+individual+proteins+freely+transiting+a+synthetic+nanopore%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Estimation of shape, volume, and dipole moment of individual proteins freely transiting a synthetic nanopore.</a> ACS Nano. 13 (5), 5231-5242 (2019).</li>
<li>Plesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+translocation+of+proteins+through+solid+state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Fast translocation of proteins through solid state nanopores.</a> Nano Lett. 13 (2), 658-663 (2013).</li>
<li>Schmid, S., Stömmer, P., Dietz, H., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+electro-osmotic+trap+for+the+label-free+study+of+single+proteins+and+their+conformations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanopore electro-osmotic trap for the label-free study of single proteins and their conformations.</a> Nat Nanotechnol. 16 (11), 1244-1250 (2021).</li>
<li>Shi, X., Verschueren, D. V., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+delivery+of+single+DNA+molecules+into+a+plasmonic+nanopore+for+label-free+optical+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Active delivery of single DNA molecules into a plasmonic nanopore for label-free optical sensing.</a> Nano Lett. 18 (12), 8003-8010 (2018).</li>
<li>Verschueren, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+optical+detection+of+DNA+translocations+through+plasmonic+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Label-free optical detection of DNA translocations through plasmonic nanopores.</a> ACS Nano. 13 (1), 61-70 (2019).</li>
<li>Verschueren, D., Shi, X., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-optical+tweezing+of+single+proteins+in+plasmonic+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Meth%22%5BJournal%5D)">Nano-optical tweezing of single proteins in plasmonic nanopores.</a> Small Meth. 3 (5), 1800465(2019).</li>
<li>Peri, S. S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+low+affinity+binding+interactions+between+natural+killer+cell+inhibitory+receptors+and+targeting+ligands+with+a+self-induced+back-action+actuated+nanopore+electrophoresis+%28SANE%29+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantification of low affinity binding interactions between natural killer cell inhibitory receptors and targeting ligands with a self-induced back-action actuated nanopore electrophoresis (SANE) sensor.</a> Nanotechnology. 32 (4), 045501(2020).</li>
<li>Leong, I. W., Tsutsui, M., Yokota, K., Taniguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt+gradient+control+of+translocation+dynamics+in+a+solid-state+nanopore%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Salt gradient control of translocation dynamics in a solid-state nanopore.</a> Anal Chem. 93 (49), 16700-16708 (2021).</li>
<li>Juan, M. L., Righini, M., Quidant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmon+nano-optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photon%22%5BJournal%5D)">Plasmon nano-optical tweezers.</a> Nat Photon. 5 (6), 349-356 (2011).</li>
<li>Juan, M. L., Gordon, R., Pang, Y., Eftekhari, F., Quidant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-induced+back-action+optical+trapping+of+dielectric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Phys%22%5BJournal%5D)">Self-induced back-action optical trapping of dielectric nanoparticles.</a> Nat Phys. 5 (12), 915-919 (2009).</li>
<li>Pang, Y., Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping+of+12+nm+dielectric+spheres+using+double-nanoholes+in+a+gold+film%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical trapping of 12 nm dielectric spheres using double-nanoholes in a gold film.</a> Nano Lett. 11 (9), 3763-3767 (2011).</li>
<li>Pang, Y., Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping+of+a+single+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical trapping of a single protein.</a> Nano Lett. 12 (1), 402-406 (2012).</li>
<li>Kotnala, A., Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+high-efficiency+trapping+of+nanoparticles+in+a+double+nanohole+optical+tweezer%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Quantification of high-efficiency trapping of nanoparticles in a double nanohole optical tweezer.</a> Nano Lett. 14 (2), 853-856 (2014).</li>
<li>Booth, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+the+dynamic+polarizability+of+macromolecules+for+single-molecule+optical+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Modelling of the dynamic polarizability of macromolecules for single-molecule optical biosensing.</a> Sci Rep. 12 (1), 1995(2022).</li>
<li>Yousefi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+monitoring+of+in+situ+Iron+loading+into+single%2C+native+ferritin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical monitoring of in situ Iron loading into single, native ferritin proteins.</a> Nano Lett. 23 (8), 3251-3258 (2023).</li>
<li>Yousefi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Flexibility+and+Disassembly+Kinetics+of+Single+Ferritin+Molecules+Using+Optical+Nanotweezers%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Structural Flexibility and Disassembly Kinetics of Single Ferritin Molecules Using Optical Nanotweezers.</a> ACS Nano. 18 (24), 15617-15626 (2024).</li>
<li>Peters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+landscape+of+conformational+changes+for+a+single+unmodified+protein%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biosens%22%5BJournal%5D)">Energy landscape of conformational changes for a single unmodified protein.</a> NPJ Biosens. 1 (1), 14-14 (2024).</li>
<li>Peters, M., McIntosh, D., Branzan Albu, A., Ying, C., Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+tracking+of+proteins+through+plasmon-enhanced+interference%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nanosci+Au%22%5BJournal%5D)">Label-free tracking of proteins through plasmon-enhanced interference.</a> ACS Nanosci Au. 4 (1), 69-75 (2024).</li>
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<li>Yang-Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+small+molecule+activator+binding+to+single+PR65+protein%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biosensing%22%5BJournal%5D)">Direct observation of small molecule activator binding to single PR65 protein.</a> NPJ Biosensing. 2 (1), 1-10 (2025).</li>
<li>Yang, W., van Dijk, M., Primavera, C., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIB-milled+plasmonic+nanoapertures+allow+for+long+trapping+times+of+individual+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">FIB-milled plasmonic nanoapertures allow for long trapping times of individual proteins.</a> iScience. 24 (11), 103237(2021).</li>
<li>Koya, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+plasmonic+nanocavities+for+optical+trapping-assisted+biosensing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Optical+Mater%22%5BJournal%5D)">Novel plasmonic nanocavities for optical trapping-assisted biosensing applications.</a> Adv Optical Mater. 8 (7), 1901481(2020).</li>
<li>Goswami, A., Umashankar, R., Gupta, A. K., Aravindan, S., Rao, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+microstructured+surface+using+the+FIB%5BTitle%5D)+AND+%22J+Micromanufact%22%5BJournal%5D)">Development of a microstructured surface using the FIB.</a> J Micromanufact. 1 (1), 53-61 (2018).</li>
<li>Onuta, T. D., Waegele, M., DuFort, C. C., Schaich, W. L., Dragnea, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+field+enhancement+at+cusps+between+adjacent+nanoapertures%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical field enhancement at cusps between adjacent nanoapertures.</a> Nano Lett. 7 (3), 557-564 (2007).</li>
<li>Al-Ani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+PEG-thiol+derivatives+on+controlling+cellular+and+bacterial+interactions+with+gold+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Surf+Sci%22%5BJournal%5D)">The influence of PEG-thiol derivatives on controlling cellular and bacterial interactions with gold surfaces.</a> Appl Surf Sci. 462, 980-990 (2018).</li>
<li>Schuler, B., Hofmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+spectroscopy+of+protein+folding+dynamics-expanding+scope+and+timescales%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule spectroscopy of protein folding dynamics-expanding scope and timescales.</a> Curr Opin Str Biol. 23 (1), 36-47 (2013).</li>
<li>Kopac, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+corona%2C+understanding+the+nanoparticle-protein+interactions+and+future+perspectives%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Protein corona, understanding the nanoparticle-protein interactions and future perspectives: A critical review.</a> Int J Biol Macromol. 169, 290-301 (2021).</li>
<li>Li, X., Guo, W., Xu, R., Song, Z., Ni, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+mechanism+between+gold+nanoparticles+and+proteins%3A+Lysozyme%2C+trypsin%2C+pepsin%2C+%CE%B3-globulin%2C+and+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Spectrochim+Acta+A+Mol+Biomol+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">The interaction mechanism between gold nanoparticles and proteins: Lysozyme, trypsin, pepsin, γ-globulin, and hemoglobin.</a> Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 272, 120983(2022).</li>
<li>Emilsson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strongly+stretched+protein+resistant+poly%28ethylene+glycol%29+brushes+prepared+by+grafting-To%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Inter%22%5BJournal%5D)">Strongly stretched protein resistant poly(ethylene glycol) brushes prepared by grafting-To.</a> ACS Appl Mater Inter. 7 (14), 7505-7515 (2015).</li>
<li>Theil, E. C., Liu, X. S., Tosha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gated+pores+in+the+ferritin+protein+nanocage%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Gated pores in the ferritin protein nanocage.</a> Inorg Chim Acta. 361 (4), 868-874 (2008).</li>
<li>Theil, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ferritin+iron+entry+and+exit+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">The ferritin iron entry and exit problem.</a> Inorg Chim Acta. 297 (1), 242-251 (2000).</li>
<li>Takahashi, T., Kuyucak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+threefold+and+fourfold+channels+in+Ferritin+D%3Ddeduced+from+electrostatic+calculations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Functional properties of threefold and fourfold channels in Ferritin D=deduced from electrostatic calculations.</a> Biophys J. 84 (4), 2256-2263 (2003).</li>
<li>Gemeinhardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+single+proteins+secreted+from+living+cells+via+iSCAT+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iSCAT microscopy.</a> J Vis Exp. (141), e58486(2018).</li>
<li>Piliarik, M., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+optical+sensing+of+single+unlabelled+proteins+and+super-resolution+imaging+of+their+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites.</a> Nat Comm. 5 (1), 4495(2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>100x Objektiv (NA = 1,25)</td><td>Olympus</td><td>PLN100XO</td><td>Öl nur mit Linsenreinigungstuch in einer Bewegung reinigen</td></tr><tr><td>12-1 bidirektionales Drehventil</td><td>Elveflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3/2-Wege-Magnetventil</td><td>Elveflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x Objektiv (NA = 0,1)</td><td>Olympus</td><td>PLN4XP</td><td></td></tr><tr><td>Airgun</td><td>RS Komponenten</td><td>666-6772</td><td></td></tr><tr><td>Avalanche-Fotodiode (APD)</td><td>Thorlabs</td><td>APD120A/M</td><td>Nicht übersättigen, 50 MHz Bandbreite, statisch empfindlich</td></tr><tr><td>Butterfly-Laserdiode</td><td>Thorlabs</td><td>FPL852S</td><td></td></tr><tr><td>Ladungsgekoppeltes Gerät (Kamera)</td><td>Hikrobot</td><td>MV-CE200-10UC</td><td></td></tr><tr><td>Kristallisationsschale</td><td>VWR</td><td>216-0065</td><td></td></tr><tr><td>Datenerfassungskarte&nbsp;</td><td>National instruments</td><td>USB-6361</td><td>2 MHz Abtastrate</td></tr><tr><td>Doppelseitiges Klebeband</td><td>Adhesive Research Inc</td><td>ARcare92712</td><td>Geeignete Form für Durchflusszelle mit einem Laserschneider zuschneiden</td></tr><tr><td>Nur Ethanol</td><td></td><td></td><td>Abzugshaube, Handschuhe verwenden</td></tr><tr><td>Fibreport-Kollimator</td><td>Thorlabs</td><td>PAF2-A7B</td><td></td></tr><tr><td>Glasmikroskop-Deckgläser (Dicke 0,17 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Halbwellenplatte</td><td>Thorlabs</td><td>AHWP10M-980</td><td></td></tr><tr><td>Ideal-tek 120 mm, Edelstahl, gerade Pinzette</td><td>RS Components</td><td>282-7472</td><td>Zum Halten von Proben und zum Schälen von doppelseitigem Klebeband</td></tr><tr><td>Nur Isopropanol (IPA)</td><td></td><td></td><td>Abzug, nur Handschuhe verwenden</td></tr><tr><td>Linsenreinigungstuch</td><td>Thorlabs</td><td>MC-5</td><td></td></tr><tr><td>Metrosil schnell vervielfältigende Silikonteile A und B</td><td>Metrodent</td><td>MSILR/1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger (75 mm x 26 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modulare optische Pinzette System</td><td>Thorlabs</td><td>OTKB/M-CUSTOM</td><td></td></tr><tr><td>Objektivöl</td><td>Olympus</td><td></td><td>Handschuhe verwenden, zwischen 2oC-8oC</td></tr><tr><td>Fotodioden-Laserhalterung</td><td>Thorlabs</td><td>CLD1015</td><td></td></tr><tr><td>Piezoelektrischer Controller</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td>MDT693B</tr><tr><td>Piezoelektrischer Tisch</td><td>Thorlabs</td><td>Nanomax 300</td><td></td></tr><tr><td>Plankonvexe Linse (f = -50 mm)</td><td>Thorlabs</td><td>LC1715-B</td><td></td></tr><tr><td>Plankonvexe Linse (f = 150 mm)</td><td>Thorlabs</td><td>LA1433-B</td><td></td></tr><tr><td>Plankonvexe Linse (f = 60 mm)</td><td>Thorlabs</td><td>LA1134-B</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethylenglykol) methylether thiol (PEG-thiol) 800 MW</td><td>Sigma Aldrich</td><td>729108</td><td>Lagerung zwischen 2oC-8oC PTFE-Schlauch</td></tr><tr><td>(ID: 0.18 mm)</td><td>Vici Jour</td><td>JR-T-6805-M25</td><td></td></tr><tr><td>PTFE-Schlauch (ID: 0.8 mm)</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-21942-72</td><td></td></tr><tr><td>SEM-FIB</td><td>Zeiss Crossbeam</td><td>550</td><td>Gallium-Ionenquelle</td></tr><tr><td>Shortpass dichroitischer Spiegel 805 nm</td><td>Thorlabs</td><td>DMSP805</td><td></td></tr><tr><td>Silberspiegel</td><td>Thorlabs</td><td>PF-10-03-P01</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4511</td><td></td></tr><tr><td>Weller Erem 120 mm Edelstahl, flache, abgerundete Pinzette</td><td>RS Komponenten</td><td>176-1150</td><td>Zum Halten von Glasdeckglas und Schälkleber von der Durchflusszelle</td></tr></tbody></table>

Überwachung der konformationsdynamik einzelner unmodifizierter proteine mit einer plasmonischen nanopinzette

Monitoring Conformational Dynamics of Single Unmodified Proteins using Plasmonic Nanotweezers

Nach der Datenerfassung kann eine Datenanalyse der Rohdaten mithilfe von MATLAB-Code durchgeführt werden, um Ablaufverfolgungen aus den vom APD gesammelten Rohdaten zu generieren. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel für eine Trapping-Spur einschließlich der Baseline vor dem Trapping, dem Trapping-Ereignis, bei dem eine große Änderung der Transmission (ΔT/T0) und der Standardabweichung beobachtet wird, bevor der Laser für etwa 5 Sekunden ausgeschaltet wird, bevor er wieder eingeschaltet wird. Eine signifikante Verringerung der Standardabweichung und die Rückkehr der Übertragung auf ein ähnliches Niveau wie der Ausgangswert deuten auf die Freisetzung von Protein hin. Die lineare Drift wird mit der MATLAB-Funktion detrend.m aus der Kurve entfernt, und dann wird der Mittelwert der Daten wieder zur trendbereinigten Kurve addiert. Gelegentlich müssen wir den Trend der Kurve verringern, da der Aufbau im Laufe der Zeit driftet, was zu einer linearen Abnahme der Transmission führt (siehe graue Kurve in Abbildung 3). Geringe Änderungen in den Baseline-Traces vor und nach dem Trapping sind auf die Stufenanpassung zurückzuführen, um die Baseline mit minimaler Standardabweichung zu optimieren, wie in Abbildung 4A dargestellt. Manchmal sind Proteinmoleküle in der Spur sichtbar, ohne eingeschlossen zu sein, was als vorbeigehende Proteine bezeichnet wird. Vorbeigehende Proteine erscheinen als eine starke Änderung der Transmission, ähnlich einer typischen Falle (Abbildung 4B), jedoch mit einer deutlich kürzeren Dauer, wie in Abbildung 4A gezeigt. Die spektrale Leistungsdichte (PSD) stellt eine weitere Analyse dar, um das Einfangen von Proteinen zu bestätigen, indem die Signalstärke bei verschiedenen Frequenzen bereitgestellt wird. Konformationsbewegungen von Proteinen werden typischerweise im Bereich von &gt;1 μs mit Einzelmolekülspektroskopiemethoden40 beobachtet. Abbildung 4C zeigt, dass das Einfangen eines Proteins im Vergleich zum Ausgangswert zu einer höheren Signalstärke führt, zumindest im Bereich von 10 kHz (&gt; 100 μs). Es unterstreicht auch, wie wichtig es ist, den Tisch auf eine optimierte Grundlinie auszurichten, da eine schlechte Grundlinie das Rauschen bei Frequenzen zwischen 50 und 500 Hz erhöhen kann, einem Frequenzbereich, der von Proteinkonformationsbewegungen überlagert wird.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68093/68093fig03.jpg"> 
Abbildung 3: Vollständige Fangspur für ein einzelnes Protein. Repräsentative Spur für eine vollständige Falle, einschließlich der Baseline, des Einfangens eines Proteins und der Freisetzung des Proteins. Sprünge in der Leiterbahn vor und nach dem Überfüllen sind auf die Ausrichtung zurückzuführen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/68093fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68093/68093fig04.jpg"> 
Abbildung 4: Häufige Ablaufverfolgungsereignisse. (A) Beispiele für eine Ausrichtung von einer schlechten zu einer guten Basislinie und ein Protein, das nahe am Hotspot vorbeigeht. (B) Trapping-Trace, die den Prozess von der Baseline, wenn der DNH-Hotspot leer ist, bis zum Zeitpunkt, an dem das Protein gefangen ist, zeigt. (C) Diagramm der spektralen Leistungsdichte (PSD) zwischen den guten und schlechten Ausgangslinien, die in (A) dargestellt sind, und dem in (B) gefangenen Protein. Höhere PSD-Werte weisen auf ein stärkeres Rauschen bei bestimmten Frequenzen hin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/68093fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die meisten Überfüllungsereignisse folgen dem gleichen allgemeinen Muster wie die Spur in Abbildung 3, obwohl während der Experimente gelegentlich Probleme auftreten können. Bei den meisten Experimenten sollte das Protein manuell freigesetzt werden, indem der Laser ausgeschaltet wird, sobald das gewünschte Experiment abgeschlossen ist. In einigen Fällen kann das Protein die Falle jedoch ohne Eingreifen verlassen, wie in Abbildung 5A gezeigt. Umgekehrt können Proteine manchmal auch nach dem Ausschalten des Lasers an der Fangstelle verbleiben, wahrscheinlich weil das Protein an der Probe haftet. Dieses Verkleben führt zu einer verrauschten Spur nach dem Aus- und Einschalten des Lasers (siehe Abbildung 5B). Die Wahrscheinlichkeit, dass dies geschieht, hängt vom Protein ab, da einige Proteine anfälliger für Oberflächenadsorption sind41,42. Die Verwendung einer Beschichtung wie PEG-Thiol kann die Wahrscheinlichkeit eines Protein-Haftens verringern39,43. Wenn dies nicht gewünscht ist, wie z. B. bei der Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen, ist ein weiteres Problem die doppelte Falle, bei der ein zweites Protein nach der ersten Falle gefangen wird. Diese ist gekennzeichnet durch einen weiteren starken Anstieg der Transmission, ähnlich wie bei der ersten Falle, und eine Änderung der Standardabweichung (siehe Abbildung 5C). 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68093/68093fig05.jpg"> 
Abbildung 5: Beispiele für unerwünschte Trapping-Ereignisse. (A) Unbeabsichtigte Freisetzung eines Proteins aus dem DNH-Hotspot. (B) Beispiel für ein Protein, das an der Probenoberfläche im DNH-Hotspot hängen bleibt. (C) Ein Spurensprung tritt auf, wenn ein zweites Protein gefangen wird, während das erste noch im DNH-Hotspot verbleibt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/68093fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ein repräsentatives Experiment, das an der in situ Eisenbeladung eines Apo-Ferritin-Moleküls durchgeführt wurde, zeigt die Verwendung einer plasmonischen Nanopinzette als Werkzeug zur Untersuchung der Konformationsdynamik von Proteinen29. Ferritin ist ein Eisenträgerprotein, das in zwei Zuständen vorliegt: Apo-Ferritin, das kein Eisen enthält, und Holo-Ferritin, das mit Eisengefüllt ist 44,45. Eisen gelangt durch 3-fache Kanäle in das Protein, wo es zu Eisen oxidiert und im Proteinkerngespeichert wird 46. Abbildung 6A zeigt eine typische Einfangspur von Apo-Ferritin mit einer eisenhaltigen Lösung, die über 20 Minuten lang infundiert wird, während das Protein eingeschlossen ist. Die 20-s-Spuren, die entlang der gesamten Spur an den Punkten b-e genommen wurden, geben Aufschluss über die Veränderungen, die am Protein im Laufe der Zeit auftreten. In Abbildung 6B ist Apo-Ferritin in einem Standard-PBS-Puffer gefangen, und es werden keine signifikanten Veränderungen in der Spur beobachtet. Abbildung 6C, D zeigt Fluktuationen in der S.D der Spuren, die durch die Eisenbeladung des Proteins durch seine 3-fachen Kanäle verursacht werden, was zu einem dynamischeren Zustand (Apo-) führt, in dem die Kanäle offen sind, und einem kompakteren Zustand (Holo-) mit geschlossenen Kanälen. Nachdem das Ferritinmolekül mit Eisen gefüllt wurde, ging es in seine Holoform über, was zu einer stabilen Einklemmspur führte, wie in Abbildung 6E gezeigt. Wahrscheinlichkeitsdichtefunktionen (PDF) in Abbildung 6B-E zeigen außerdem die Veränderungen, die das Protein erfährt, wenn es im Laufe der Zeit verschiedenen Lösungsbedingungen ausgesetzt wird.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68093/68093fig06.jpg"> 
Abbildung 6: In situ Eisenbeladung in ein eingeschlossenes Apoferritin. (A) Vollständige Transmissionsspur eines DNH mit eingeschlossenem Apoferritin-Molekül, gefolgt von der Injektion einer eisenhaltigen Lösung an die Einfangstelle, um die Konformationsänderungen des Ferritins in Verbindung mit der Eisenbeladung zu beobachten. (B) 20-s-Einschlussspur eines Apoferritins, das eingeschlossen wurde, bevor die eisenhaltige Lösung den Hotspot erreichte. (C, D) 20-s-Fangspuren, nachdem das Apoferritinmolekül der eisenhaltigen Lösung ausgesetzt wurde. Blaue und violette Segmente markieren den oberen und unteren S.D. der Spur und weisen auf flexible bzw. starre Ferritinkonformationen hin. (E) 20-s-Fangspur, nachdem Apoferritin &gt;20 Minuten lang der eisenhaltigen Lösung ausgesetzt wurde. Die Diagramme der Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion (PDF) auf der rechten Seite zeigen die Verteilung der Übertragung und sind farbcodiert in den blauen und violetten Segmenten. Diese Zahl wurde von29 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/68093fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung 1: Gold-DNH-Probe, die auf der 3D-gedruckten Durchflusszelle montiert ist. Die Probe wird in einen speziellen Schlitz gelegt und mit doppelseitigem PET-Klebeband auf die Durchflusszelle geklebt. Wichtige Parameter und zugehörige Messungen für unser Durchflusszellendesign sind gekennzeichnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/SI-1%20Sample%20mounted%20in%20flow%20cell_amended.tif" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 2: Rückseite der Durchflusszelle mit goldener DNH-Probe montiert und Innenwand beschriftet. Die Probe wird in der Durchflusszelle mit Dupliziersilikon versiegelt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/SI-2%20Inner%20wall%20of%20hole%20in%20flow%20cell.tif" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 3: Diagramm der Durchflusszelle mit goldenem DNH, montiert mit beschrifteten Ein- und Auslasslöchern. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/SI-3%20Intake%20and%20outtake%20holes.tif" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Überwachung der Konformationsdynamik einzelner unmodifizierter Proteine mit einer plasmonischen Nanopinzette

Current single-molecule techniques to characterize proteins typically require labels, tethers, or the use of non-native solution conditions. Such changes ...

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Research

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Ingenieurwesen

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Überwachung der Konformationsdynamik einzelner unmodifizierter Proteine mit einer plasmonischen Nanopinzette

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