Isolierung und Kultivierung von primären retinalen Müller-Zellen aus Sprague-Dawley (SD) Ratten

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultivierung von primären retinalen Müller-Zellen aus Sprague-Dawley SD-Ratten, die die Netzhautforschung in der wissenschaftlichen Gemeinschaft unterstützen können. Das Protokoll umfasst die Sektion der Netzhaut, die CI-Extraktion und -Identifizierung sowie wichtige Kontrollüberlegungen. Dieses Protokoll stellt eine effiziente, standardisierte und kostengünstige effektive Methode zur Extraktion und Wiederherstellung von RMCs aus Ihren legalen SD-Racks dar. Das RMC-Modell kann verwendet werden, um pathologische Zustände wie Diabetes, die Normalität und die Wirkung von Medikamenten zu simulieren.

[Erzähler] Gießen Sie zunächst die Lösung von D-Hank in zwei 10 Zentimeter große Glaskulturschalen. Nachdem Sie die neugeborene SD-Ratte eingeschläfert und desinfiziert haben, positionieren Sie sie auf einer sterilen, gebogenen Schale. Reißen Sie mit einer Zahnpinzette die Augenlidhaut entlang der Lidspalte auf, um den Augapfel der Ratte freizulegen. Halten Sie die zahnlose Pinzette offen und parallel zur Lidspalte, um die Augenhöhle nach unten zu drücken. Sobald der Sehnerv erreicht und der Augapfel freigelegt ist, schließen Sie die Pinzette, um den Augapfel anzuheben und herauszuziehen. Lege nun den Augapfel in eine Kulturschale aus Glas mit der Lösung von D-Hank. Spülen Sie den Augapfel aus und geben Sie ihn in eine andere Schüssel mit frischer D-Hank's Lösung. Fixieren Sie dann mit einer gebogenen ophthalmischen Mikrozange vorsichtig den Bereich zwischen Hornhaut und Sehnerv, um die Hornhaut freizulegen. Stechen Sie den Hornhaut-Sklera-Übergang mit einer Mikro-Hornhautschere ein und schneiden Sie kreisförmig entlang des Limbus. Machen Sie zwei symmetrische Skleraschnitte von etwa zwei Millimetern Länge, bevor Sie die Pinzette lösen und am Übergang von Sehnerv und Sklera wieder einklemmen. Drücken Sie dann mit einer zweiten Pinzette sanft in die Nähe der Sehnervenwurzel und richten Sie den Druck auf die Schnittstelle des Sehnerven. Wenn das Linsengewebe zum Vorschein kommt, entfernen Sie es vorsichtig und drücken Sie weiter, bis das Netzhautgewebe herauskommt. Übertragen Sie das abgetrennte Netzhautgewebe mit einer Pinzette in eine andere sterile Kulturschale. Öffnen Sie den Deckel der Kulturschale und pipettieren Sie das Netzhautgewebe mit einer Ein-Milliliter-Spitze etwa 15 Mal auf und ab, um es in kleine Stücke zu brechen. Inkubieren Sie das Gewebe dann fünf Minuten lang mit einem Milliliter 0,25 % Trypsin bei 37 Grad Celsius. Nehmen Sie die Kulturschale aus dem Inkubator und stellen Sie sie auf die Reinbank. Fügen Sie zwei Milliliter des vollständigen Mediums hinzu und pipettieren Sie vorsichtig, um den Aufschluss zu stoppen. Filtern Sie nun die Zellsuspension durch ein 300 Mesh Nylonsieb in eine 15 Milliliter Zentrifuge zwei. Waschen Sie die Kulturschale mit vorbereitetem PBS und sammeln Sie die restliche Suspension. Dann drehen Sie die Röhre fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 878 G. Nach der Zentrifugation den Überstand aspirieren und verwerfen. Das Pellet wird in zwei Millilitern Vollmedium resuspendiert und erneut fünf Minuten lang bei 878 g zentrifugiert, um die Zellen zu reinigen. Nach dem Verwerfen des Überstands werden die Zellen in zwei Millilitern vollständigem Medium resuspendiert. Nehmen Sie einen T25-Kolben mit drei Millilitern Vollmedium und fügen Sie einen Milliliter der Zellsuspension hinzu. Schütteln Sie den Kolben in einem Kreuzmuster, bevor Sie ihn in den Inkubator stellen. Nach 48 Stunden Inkubation nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und stellen Sie ihn auf die Reinbank. Entsorgen Sie das verbrauchte Medium und waschen Sie die zellhaftende Oberfläche dreimal mit einem Milliliter PBS, das 1% Penicillin plus Streptomycin enthält. Fügen Sie dann fünf Milliliter frisches, vollständiges Medium hinzu und setzen Sie die Inkubation fort, bis die Zellkonfluenz 90 % übersteigt. Waschen Sie die Zellen dreimal mit einem Milliliter PBS, das 1% Penicillin-Streptomycin enthält. Inkubieren Sie dann die Zellen mit einem Milliliter 0,25%iger Trypsin-EDTA-Lösung für eine Minute und 30 Sekunden. Betrachten Sie nun den Kolben unter einem inversen Mikroskop. Wenn die Zellen rund und abgelöst erscheinen und zu schwimmen beginnen, geben Sie zwei Milliliter vollständiges Kulturmedium in den Kolben, um die Verdauung zu beenden. Verwenden Sie dann eine Pipette, um die Zellsuspension zu aspirieren, und übertragen Sie die gesamte Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie die Kolbenwand mit zwei Millilitern PBS, das 1 % Penicillin-Streptomycin enthält, und geben Sie es in dasselbe Röhrchen. Das Röhrchen wird bei 878 g fünf Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in einem geeigneten Volumen des vollständigen Mediums resuspendiert. Zum Schluss passieren Sie die Zellen je nach Bedarf in einem Verhältnis von eins zu zwei oder eins zu drei. Zweite Passage: retinale Müller-Zellen oder RMCs zeigten sternförmige oder spindelförmige Morphologien mit runden oder ovalen Kernen und reichlich Zytoplasma. Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen zeigten spindel- und sternförmige Zellen mit reichlich rosa Zytoplasma und zentral angeordneten ovalen Kernen, die durch feine filamentöse Strukturen miteinander verbunden sind. Die Immunfluoreszenzfärbung von RMCs zeigte eine starke rote Fluoreszenz in Zellen, die für Glutaminsynthetase und Aquaporin-4 markiert waren, und eine hellgrüne Fluoreszenz für CRALBP, Kir4.1 und Vimentin. NeuN wurde die Negativkontrolle in der Immunfluoreszenzanalyse nicht nachgewiesen, was die Spezifität der RMC-Isolierung bestätigt. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass 98,7 % der Zellen positiv für Glutaminsynthetase und 97 % positiv für CRALBP waren, was auf eine hohe Reinheit der RMCs hinweist.