Etablierung und histologische Analyse von Ösophagusorganoiden zur Modellierung des Verlaufs von normalem zu krebsartigem Gewebe

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Etablierung und histologische Analyse von Organoidmodellen der Speiseröhre, die verschiedene Stadien der Tumorprogression repräsentieren. Diese Methode ermöglicht es den Forschern, Veränderungen in der zellulären Morphologie, der räumlichen Organisation und den Expressionsmustern molekularer Marker während des Übergangs von normalem zu krebsartigem Gewebe zu untersuchen.

Unsere Forschungsschwerpunkte liegen in der Tumorinitiierung und der frühen Tumorgenese. Wir untersuchen, wie sich normale Zellen in Tumorzellen verwandeln und wie diese Zellen ihre Mikroumgebung verändern, um die Tumorentstehung zu erleichtern. Gegenwärtig gibt es viele Technologien, die zur Förderung der Forschung eingesetzt werden, darunter Stammzelltechnologien, Gen-Editing-Technologien, fortschrittliche 3D-Kultursysteme und Biomaterialien sowie Einzelzell- und Spatial-Omics-Technologien. Die größte Herausforderung besteht darin, Organoide frei von Bakterien und Pilzen zu halten. Diese Verunreinigungen schleichen sich bei der Handhabung und dem Transport von Gewebe ein und ruinieren oft unsere Kulturen.

[Dozent] Zu Beginn tauen Sie die Basalmembranmatrix und das humane Organoid-Kulturmedium der Speiseröhre bei vier Grad Celsius auf. Füllen Sie die Gewebeprobe in Fünf-Milliliter-Zentrifugenröhrchen um und waschen Sie die Probe dann dreimal mit Waschpuffer bei Raumtemperatur. Zerkleinern Sie das Gewebe mit einer sterilen Schere in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen in ein Millimeter große Würfel. Suspendieren Sie nun die Gewebefragmente in einem Milliliter Verdauungspuffer. Schütteln Sie die Mischung bei 37 Grad Celsius bei 50 bis 100 Umdrehungen pro Minute für 10 bis 20 Minuten, um das Gewebe zu verdauen. Als nächstes zentrifugieren Sie die Mischung bei 400 g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie dann den Überstand. Resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern 0,025 % Trypsin-EDTA. Inkubieren Sie die Suspension 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Fügen Sie dann einen Milliliter DMEM hinzu, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, um die enzymatische Aktivität zu stoppen. Anschließend wird die Suspension durch einen 70-Mikrometer-Sterilfilter geleitet und das Filtrat in einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen gesammelt. Zentrifugieren Sie das Filtrat fünf Minuten lang bei 400 G bei vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern H-EOCM, nachdem Sie den Überstand verworfen haben. Bestimmen Sie nach dem Resuspendieren der Zellen die Zelldichte mit Hilfe eines Zellzählers. Übertragen Sie dann 5.000 bis 15.000 Zellen pro Milliliter in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen. Für die Aussaat von Organoiden resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 50 bis 100 Mikrolitern Basalmembranmatrix. Pipettieren Sie 50 Mikroliter der Matrixzellmischung in die Mitte jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte. Inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um die Basalmembranmatrix zu polymerisieren. Pipettieren Sie nun 500 Mikroliter vorgewärmtes H-EOCM in jede Vertiefung, um die Matrix abzudecken. Dann inkubieren Sie die Platte in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius. Um das Medium zu ersetzen, saugen Sie das verbrauchte Medium an. Füllen Sie jede Vertiefung mit 500 Mikrolitern frischem H-EOCM auf, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Zur Durchführung von Multiplex-Immunfluoreszenzfärbungen an reparaffinisierten und rehydrierten Organoiden. Fügen Sie Schafsserum-Blockierungslösung hinzu, um die Organoide auf einem Objektträger in einer Feuchtigkeitskammer abzudecken, und inkubieren Sie den Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie den Objektträger zwei Minuten lang mit PBS-haltigem Tween. Lassen Sie anschließend den verdünnten Primärantikörper fallen, um den Organoidbereich abzudecken. Inkubieren Sie in einer Feuchtigkeitskammer entsprechend den Antikörperanforderungen. Waschen Sie die Objektträger nach der Inkubation zweimal für zwei Minuten bei 80 PMM in einer thermostabilen Kammer in PBS-T. Geben Sie nun die Sekundärantikörperlösung auf den Organoidbereich und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang in einer Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation waschen Sie die Objektträger in PBS-T zweimal für zwei Minuten bei 80 U/min in einer thermostabilen Kammer. Pipettieren Sie die fluoreszierende Farbstofflösung über den gewaschenen Objektträger, um den Organoidbereich abzudecken und erneut zu inkubieren. Waschen Sie die Objektträger nach der Inkubation zweimal in PBS-T. Für die Mehrfachfärbung wiederholen Sie die Antigengewinnung und die Antikörperblockierung. Lassen Sie dann eine feuchte Lösung fallen, um den Organoidbereich zu bedecken. Tauchen Sie die Objektträger zwei Minuten lang in sterilisiertes Wasser, um den überschüssigen Fleck abzuwaschen. Fügen Sie ein Antifading-Eindeckmedium hinzu und bringen Sie ein Deckglas an, bevor Sie digitale Bilder aufnehmen. Organoide Strukturen wurden vom Normal- bis zum Karzinomstadium zunehmend unorganisiert, wie die KRT6A-Färbung sichtbar machte. Die Expression von PDL1 stieg progressiv von der normalen Ösophagusschleimhaut zum Plattenepithelkarzinom der Speiseröhre an.