Eine einfache und effiziente Methode zum Testen immunmodulatorischer Wirkstoffe zur Erzeugung tolerogener dendritischer Zellen aus humanen CD14⁺ -Monozyten

Wir versuchen zu verstehen, welche immunmodulatorischen Behandlungen tolerisierte dendritische Zellen aus bereits differenzierten Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen erzeugen können, was für die Autoimmun- und Transplantationsforschung sehr wertvoll ist. Selbsttherapien werden aufgrund von Fortschritten in der Herstellung immer praktischer, und tolerogene dendritische Zellen haben sich in präklinischen Studien als vielversprechend erwiesen. Sie können antigenspezifische Toleranz erzeugen. Die häufigste ist die Zytometrie. Dies bietet eine schnelle und auch zugängliche Möglichkeit, tolerierte Zellen zu analysieren. Es ist eine Herausforderung, tolerogene dendritische Zellen zu erzeugen, die in vivo in beiden Funktionen persistieren. Aus diesem Grund gibt es keine klinisch zugelassenen dendritischen Zelltherapien für verträgliche Patienten. Wir haben in großen Screening-Studien neuartige Kombinationen von immunmodulatorischen Wirkstoffen identifiziert, die eine Verbesserung der tolerierten dendritischen Zellfunktionalität zeigen. Wir entwickeln auch Formulierungen, die Nanopartikel tolerieren.

[Dozent] Zu Beginn werden die 15-Milliliter-Röhrchen mit angereicherten menschlichen Monozyten und T-Zellen in eine Zentrifuge gegeben. Nachdem die Zentrifugation abgeschlossen ist, saugen Sie den Überstand mit einer Pipette aus den Röhrchen ab. Geben Sie einen Milliliter MODC-Kulturmedium in das Monozytenpellet, einen Milliliter T-Zell-Kulturmedium in das Röhrchen mit den T-Zellen und mischen Sie es gut, bevor Sie die Zellen zählen. Geben Sie anschließend neun Milliliter warmes MODC-Kulturmedium in die Monozytensuspension, um das endgültige Volumen von 10 Millilitern zu erhalten. Pipettieren Sie dann jeweils 100 Mikroliter GM-CSF- und IL-4-Stammlösungen. Übertragen Sie die Suspension in eine beschriftete Petrischale, die als MODC gekennzeichnet ist, und inkubieren Sie. Geben Sie anschließend einen Milliliter T-Zell-Gefriermedium in die T-Zell-Suspension. Teilen Sie die Mischung in zwei Zwei-Milliliter-Kryo-Fläschchen auf. Stellen Sie die versiegelten Kryofläschchen in eine Gefrierkammer mit Ausgleichsröhrchen in unbenutzte Vertiefungen. Geben Sie am vierten Tag fünf Milliliter frisches MODC-Kulturmedium in das Monozytenröhrchen. Pipettieren Sie dann jeweils 100 Mikroliter GM-CSF- und IL-4-Stammlösungen sieben und inkubieren Sie bis zum siebten Tag. Am siebten Tag überführen Sie die differenzierten dendritischen Zellen (MDOCs) in ein 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie wie zuvor. Geben Sie einen Milliliter warmes MODC-Kulturmedium zum Zellpellet und pipettieren Sie es auf und ab, um es gut zu vermischen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Die Suspension wird mit warmem MODC-Kulturmedium verdünnt, das GM-CSF und IL4 enthält, bis die gewünschte Zellkonzentration erreicht ist. Geben Sie 100 Mikroliter der Suspension mit 30.000 Zellen in jede Vertiefung einer 96-Well-Gewebekulturplatte mit flachem Boden. Geben Sie einen Mikroliter immunmodulatorische Arzneimittel in die dafür vorgesehenen Vertiefungen und inkubieren Sie. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die MODC-Platte fünf Minuten lang bei 300 g. Nachdem Sie den Überstand vorsichtig entfernt haben, geben Sie vorsichtig 200 Mikroliter warmes HBSS an die Seite der Platte und zentrifugieren Sie. Nach der Überstandsaspiration werden erneut 100 Mikroliter warmes MODC-Kulturmedium mit GM-CSF und IL4 zugegeben. Wenn Immunstimulation angewendet wird, geben Sie einen Mikroliter 100-fache Brühe Lipopolysaccharid in die dafür vorgesehenen Vertiefungen und inkubieren Sie. Tauen Sie am achten Tag zwei Kryo-Fläschchen in einem heißen Bead-Bad bei 37 Grad Celsius auf, bis der Inhalt zu schmelzen beginnt. Nach dem teilweisen Auftauen werden die Fläschchen in eine Zellkulturhaube überführt. Fügen Sie dann einen Milliliter warmes T-Zell-Kulturmedium hinzu, um die Zellen schnell aufzutauen. Füllen Sie den Inhalt in ein 50-Milliliter-Röhrchen um und spülen Sie die Kryo-Fläschchen mit einem zusätzlichen Milliliter T-Zell-Kulturmedium aus, um alle Zellen zu sammeln. Die Suspension mit Fließfärbelösung auf 15 Milliliter auffüllen und zentrifugieren. Das Pellet wird in fünf Millilitern Fließfärbelösung resuspendiert und erneut zentrifugiert, dann wird das Zellpellet in einem Milliliter warmem T-Zell-Kulturmedium resuspendiert, nachdem der Überstand herauspipettiert wurde. Fügen Sie neun Milliliter warmes T-Zell-Kulturmedium hinzu, um ein Endvolumen von 10 Millilitern zu erhalten. Übertragen Sie die Suspension in eine Petrischale, die als aufgetaute T-Zellen gekennzeichnet ist, und inkubieren Sie. Am achten Tag zentrifugieren Sie die MODC-Platte fünf Minuten lang bei 300 g. Nach dem Pipettieren des Überstands 200 Mikroliter Fließfärbelösung in jede Vertiefung geben und inkubieren. Pipettieren Sie dann auf und ab, um anhaftende Zellen und die Zellsuspension auf eine neue 96-Well-V-Bodenplatte zu entfernen, bevor Sie erneut zentrifugieren. Pipettieren Sie 50 Mikroliter des FC-Rezeptor-Bindungsinhibitor-Antikörpers in jede Vertiefung, nachdem Sie den Überstand aspiriert haben, um die unspezifische Bindung zu blockieren. Nachdem Sie die Platte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert haben, geben Sie 50 Mikroliter des vorbereiteten Validierungspanel-Antikörpercocktails in jede Vertiefung. Mischen Sie 50 Mikroliter Kompensationskügelchen mit 50 Mikrolitern jedes verdünnten Antikörpers in 1,5-Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie. Die Platte fünf Minuten lang bei 300 g zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern Fließfärbelösung, um die Zellen zu waschen. Nach dem abschließenden Waschen und Zentrifugieren resuspendieren Sie die Zellen in 110 Mikrolitern Durchflussfärbelösung für die durchflusszytometrische Analyse. Bei den tolerogenen MODCs wird der Antikörpercocktail durch den Toleranzpanel-Cocktail ersetzt. Am neunten Tag geben Sie die aufgetaute T-Zell-Petrischale in ein 50-Milliliter-Röhrchen und füllen das Röhrchen mit Fließfärbelösung auf. Verwenden Sie das zweite Röhrchen mit ungefärbter T-Zelle für die Trigonometrie. Die Röhrchen fünf Minuten lang bei 250 g drehen. Nach Entfernen des Überstands werden die Zellen in warmen Zellkulturmedien wieder suspendiert. Zählen Sie die T-Zellen und stellen Sie sicher, dass mindestens 4 Millionen Zellen gewonnen werden. Die MODC-Platte wird fünf Minuten lang bei 300 g zentrifugiert. Nach dem Aspirieren der Überstände geben Sie 200 Mikroliter T-Zellen in jede Vertiefung. Fügen Sie ungefärbte T-Zellen für Trigonometrie-Analyseplatten hinzu. Geben Sie 25 Mikroliter pro Milliliter Anti-CD3/CD28-Antikörpercocktail in alle Gruppen mit Ausnahme der negativen Kontrollvertiefungen, um die T-Zellen zu stimulieren und bis zum 12. Tag zu inkubieren. Übertragen Sie anschließend alle Zellsuspensionen aus der 96-Well-Kulturplatte in eine V-Bodenplatte mit Fließfärbelösung. Waschen Sie die Zellen zweimal in 200 Mikrolitern Fließfärbelösung. Reservieren Sie einige Zellen für die Kompensationskontrolle. Nach dem zweiten Waschen zentrifugieren Sie die Platte. Geben Sie dann 50 Mikroliter verdünnten FC-Rezeptor-Bindungsinhibitor-Antikörper in jede Vertiefung und inkubieren Sie. Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, geben Sie 50 Mikroliter des vorbereiteten Trigono-Panel-Antikörpercocktails in jede Vertiefung. Mischen Sie für Kompensationskontrollen 50 Mikroliter ungefärbte Kompensationszellen mit 50 Mikrolitern jedes einzelnen gefärbten Antikörpers. Inkubieren Sie die Platte und die Kompensationskontrollen eine Stunde lang bei vier Grad Celsius und waschen Sie sie dann vor dem Zentrifugieren mit Fließfärbelösung. Färben Sie nun die Zellen vor der Kaltinkubation mit Lebend/Tot-Nahinfrarot-Farbstoff, der in HBSS bei 200 Mikrolitern pro Vertiefung verdünnt ist. Waschen und zentrifugieren Sie die Platte, bevor Sie sie mit Fox P3 und einer durchflusszytometrischen Analyse färben. Am ersten Tag waren die undifferenzierten Monozyten überwiegend HLA-DR-minus mit einem kleinen CD14 minus, während die differenzierten Monozyten am siebten Tag die meisten Zellen als HLA-DR-plus, CD14 minus, CD1c-plus, CD141 plus zeigten. Die Behandlung mit Rapamycin sowohl mit als auch ohne Lipopolysaccharid reduzierte signifikant die DC-SIGN-plus CD1c-plus-Populationen und hemmte die bei der alleinigen LPS-Behandlung beobachtete Hochregulation von CD86- und CD40-Markern. FOX P3-plus T-regulatorische Zellpopulationen waren erhöht, wenn MDCs mit T-Zellen co-kultiviert wurden. Es wurden jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen den vier MODC-Behandlungsgruppen beobachtet. Die T-Zellproliferation war sowohl in CD4-plus- als auch in CD8-plus-T-Zellpopulationen nach Co-Kultur mit Rapa-behandelten MDOCs reduziert. Mit Interleukin-10 behandelte Proben erhöhte die Interleukin-10-Produktion signifikant nach 24 Stunden. Mit Dex behandelte MDOCs erhöhten die Interleukin-10-Produktion signifikant, jedoch erst nach 72-stündiger Ruhe. Die Vorbehandlung mit Dexamethason reduzierte die durchschnittliche TNF-alpha-Erzeugung nach einer LPS-Behandlung nach 24 Stunden. Signifikante Anstiege der PDL1-plus-MDOCs wurden in den mit Dex plus LPS und Rapa behandelten Gruppen nach 72 Stunden beobachtet. Eine Unterdrückung der CD86-Expression wurde in allen mit Immunmodulatoren behandelten Gruppen sowohl nach 24 als auch nach 72 Stunden beobachtet. Mit Immunmodulatoren behandelte MDOCs erhöhten die CD4-plus-T-Zellproliferation nicht.