En face Kryosektion der Netzhaut der Maus für die hochdimensionale räumliche molekulare Analyse

Die Netzhaut ist ein nützliches Modell zum Verständnis neuronaler Berechnungen. Diese Berechnungen hängen von den speziellen Positionen der Zellen ab. Umfassende Karten dazu sind jedoch bisher schwer fassbar.

In den letzten zehn Jahren lieferte die Einzelzellsequenzierung eine klare Beschreibung der Zelltypen der Netzhaut. Nun bietet die räumliche Transkriptomik eine neuartige Möglichkeit, diese Beschreibungen in intaktem Gewebe zu verwenden. Eine kritische Herausforderung bei der Verwendung von räumlicher Transkriptomik besteht darin, dass sie sehr dünne Gewebeschnitte erfordert. Die Netzhaut ist in der horizontalen Ebene, an der wir interessiert sind, bereits ziemlich dünn.

Durch die Erfindung dieser Methode zur Erstellung dünner und schneller Schnitte kann die räumliche Transkriptomik im maschinellen Lernen verwendet werden, um alle retinalen Ganglienzellen im selben Gewebe zu kartieren. In den letzten 30 Jahren wurden nur 17 von 45 retinalen Ganglienzellen von Mäusen kartiert, und diese Technik ermöglichte es uns, alle auf einmal zu kartieren.

[Dozent] Legen Sie zunächst eine euthanasierte Maus auf den Arbeitstisch. Den Schläfenpol des Globus auf die Hornhaut laufen lassen, um die Orientierung zu behalten und eine Schwachstelle für die Dissektion zu schaffen. Tauchen Sie den Globus und die Lösung in eine Schale, in der sich ein Stück Filterpapier befindet. Mit einer scharfen Zange Nummer fünf und einer Irisschere entfernen Sie vorsichtig alle Muskeln, Faszien, Gefäße und Nerven von der Kugel, ohne die Sklera zu punktieren. Positionieren Sie die Spitze einer Iris-Scherenklinge senkrecht zur Hornhautmarke. Durchstechen Sie den Globus an dieser Stelle. Machen Sie einen einzigen sauberen Schnitt durch die Hornhaut und den Limbus, der sich in der Sklera und der Netzhaut in Richtung des Sehnervenkopfes fortsetzt. Positionieren Sie dann die Klinge senkrecht zum ersten Schnitt, etwa einen Millimeter hinter dem Limbus. Beginnen Sie, radial durch die Sklera und die Netzhaut zu schneiden. Halten Sie eine gleichmäßige Schnittlinie posterior und parallel zum Limbus aufrecht, indem Sie den Globus mit einer scharfen Pinzette führen und drehen. Wenn sich Netzhaut und Sklera trennen, positionieren Sie die Irisschere neu, um sie zusammenzuschneiden. Schätzen Sie den Abstand von einem Millimeter nach hinten mit der mittleren Breite der Iris-Scherenklinge. Nach Abschluss des radialen Schnitts parallel zum Limbus auf verbleibende Netzhautverbindungen prüfen. Trennen Sie diese vorsichtig mit einer Irisschere, bis der vordere und der hintere Globusabschnitt getrennt sind. Verwenden Sie als Nächstes zwei Paar scharfe Pinzetten mit der Nummer fünf, um den vorderen und hinteren Teil des Globus vorsichtig zu trennen. Wenn bei älteren Mäusen transparente Fasern die Linse mit der Netzhautschale verbinden, trennen Sie diese vorsichtig mit einer Irisschere, während Sie die Trennung der Netzhautsklera minimieren. Schneiden Sie die Netzhaut mit dem Filterpapier als Stützplattform mit einer Irisschere in ein Kleeblatt, auch Eisernes Kreuzmuster genannt. Wiederholen Sie die Dissektion mit dem zweiten Auge. Schneiden Sie die Spitze einer Einweg-Transferpipette aus Kunststoff ab, um eine Öffnung zu erhalten, die größer ist als die präparierte Netzhaut und Sklera. Saugen Sie die Netzhaut vorsichtig in die Pipette und legen Sie sie auf einen Objektträger aus Glasmikroskop. Entfernen Sie mit einem Labortuch überschüssige Ziellösung, bis die Netzhaut nicht mehr schwimmt und abgeflacht werden kann. Entfalten Sie nun mit zwei scharfen Pinzetten die Netzhaut und positionieren Sie sie flach mit der inneren Augenmuschel nach oben. Machen Sie in jedem Kleeblatt-Reliefsegment 0,5 bis zwei Millimeter lange Reliefschnitte, um das Abflachen zu erleichtern, und passen Sie es an, um ein Falten zu verhindern. Entfernen Sie alle Reste der Ziellösung mit Ausnahme der Flüssigkeit, die an die Netzhaut angrenzt. Drücken und übertragen Sie die Netzhaut mit einem Deckglas schnell so, dass die äußere Sklera nach oben zeigt und die innere Augenmuschel mit dem Deckglas in Kontakt kommt. Vergewissern Sie sich, dass die Netzhaut nicht gefaltet ist, und nehmen Sie bei Bedarf Anpassungen vor. Fügen Sie eine Aimlösung hinzu, um die Manipulation zu erleichtern, aber entfernen Sie überschüssiges Material mit einem Tuch, um ein Kräuseln zu verhindern, und lassen Sie es fünf bis 10 Sekunden lang an der Luft trocknen. Tragen Sie nun OCT medium auf, um die Netzhaut zu bedecken. Verteilen Sie dann die Schicht mit einer Pinzette gleichmäßig auf dem Deckglas, um ein Aufschwimmen zu verhindern. Schockfrosten Sie die Netzhaut in einem OCT-Medium mit einer Metallplatte, die mit flüssigem Stickstoffdampf gekühlt wird, oder durch direkten Kontakt mit Trockeneis. Bewahren Sie die gefrorene Netzhaut zur sofortigen Verwendung auf Trockeneis auf. Für die Kryosektion erstellen Sie eine OCT-Kuppel auf dem Probenfutter, die die inneren zwei bis drei Ringräume einnimmt, wenn das gleiche Kryostatenmodell verwendet wird. Richten Sie das Probenfutter flach zur Schneidfläche aus. Erstellen oder notieren Sie die Orientierungshilfe, die das Spannfutter mit dem Kryostatentisch in Verbindung bringt. Schneiden Sie dann die Kuppel so ab, dass eine flache Fläche parallel zur Klinge entsteht. Entfernen Sie mit einer Rasierklinge überschüssiges OCT seitlich und trennen Sie die Netzhaut vorsichtig vom Deckglas, um sie beweglich zu machen. Nehmen Sie das Spannfutter vom Tisch und geben Sie einen kleinen Tropfen flüssiges OCT auf die vorbereitete ebene OCT-Oberfläche. Legen Sie dann die Netzhaut direkt auf das flüssige OCT. Verwenden Sie einen vorgekühlten Objektträger, um die Netzhaut zu drücken und zu halten, bis sie gefroren ist. Tragen Sie mehr OCT auf die Netzhaut und das Spannfutter auf, um die Bindung zu gewährleisten. Anschließend frieren Sie die Baugruppe im Kryostat-Schnellgefrierbereich ein. Schneiden Sie zum Schneiden überschüssiges OCT vorsichtig ab, bis die Netzhaut sichtbar ist. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Kanten des OCT-Blocks nahe an der Netzhaut zu formen. Fahren Sie mit dem Trimmen fort, während Sie auf Sklera prüfen. Wenn die Sklera sichtbar ist, passen Sie den Tischwinkel nach Bedarf an. Beenden Sie das Trimmen, wenn die Sklera ungefähr gleichmäßig über die Abschnitte verteilt ist. Verwenden Sie nun vorgekühlte Folien und zwei Pinsel, um die Abschnitte zu bearbeiten und zu sammeln. Legen Sie einen Finger etwa fünf Sekunden lang unter den Schnitt, bis das OCT schmilzt und das Gewebe am Objektträger haftet. Stellen Sie den Objektträger dann zum erneuten Einfrieren wieder auf eine kalte Oberfläche. Bewahren Sie die vorbereiteten Objektträger für den sofortigen Gebrauch auf Trockeneis auf. Eine ausgeprägte Immunreaktivität (RBPMS) in der Ganglienzellschicht und eine klare Trennung der mit Tomatenlektin markierten Gefäßplexi bestätigten die erfolgreiche Konservierung der retinalen Laminierungs- und Proteinmarker. Der Multiplex-RNA-Nachweis mit einem 12-Plex-RNA-Scope-Panel behielt erfolgreich die räumliche Struktur bei und zeigte eine deutliche Expression von Markern wie Grm6 und RBPMS auf der Gesichtsscheibe. Hochauflösende Bilder bestätigten Einzelzellexpressionsmuster für RBPMS und andere Marker wie Mafb6 und Meis2 und validierten sowohl die Protein- als auch die RNA-Lokalisierung in der Ganglienzellschicht. Eine gleichmäßige Signalverteilung über Kleeblattschnitte und starke Signale in räumlichen Xenium-Transkriptomdaten bestätigten das erfolgreiche Hochdurchsatz-Profiling und die RNA-Integrität. Die Visualisierung der Einzelzellauflösung unter Verwendung von manuellen Erkennungsmustern, die mit Xenium abgestimmt sind, bestätigen die Robustheit des Protokolls über alle Plattformen hinweg. Zelltypspezifische Transkriptmarker zeigten eine geschichtete laminare Verteilung im Netzhautquerschnitt und in der Gesichtskartierung blieb ihre Position über die Tiefe erhalten. Ein detaillierter Zoom in die Ganglienzellschicht bestätigte eine genaue räumliche Transkriptdetektion im Vergleich zur DAPI-Kernfärbung.