Hochauflösende Bildgebung von C. elegans in allen Larvenstadien

Im Labor arbeiten wir an allen möglichen entwicklungsbiologischen Fragestellungen. Ich selbst arbeite eher auf der technischen Seite und entwickle Methoden, um diese Fragen mit bildgebenden Verfahren besser beantworten zu können. Das Gebiet von C. elegans hat eine Vielzahl von Methoden erfolgreich eingesetzt, die von CRISPR-Geneditierung über Transkriptomik und Proteomik bis hin zur hochauflösenden Mikroskopie reichen. C. elegans ist ein erstaunliches Modell, aber im Zusammenhang mit der In-vivo-Beobachtung mit hoher Auflösung bringt es seine Herausforderungen mit sich, da eine Immobilisierung für eine optimale Auflösung erforderlich ist, was wiederum die Lebensfähigkeit der Tiere einschränkt. Das Protokoll stellt eine mögliche Lösung für die Langzeitbildgebung von C. elegans dar, die es den Forschern ermöglicht, die Methode in ihrem eigenen Labor anzuwenden und eine Vielzahl dynamischer Entwicklungsprozesse direkt in vivo zu untersuchen. Im Labor ermöglichte die Methode eine detaillierte Beobachtung der Organbildung, zum Beispiel im Rahmen der Morphogenese oder bei der Verfolgung somatischer Zellteilungen bis ins Erwachsenenalter. Seitdem wurde die Methode von zahlreichen Laboren übernommen, die eine Vielzahl von Entwicklungsprozessen untersuchen.

[Moderator] Befestigen Sie das Gerät zunächst am Stützrahmen und montieren Sie es auf das aufrechte Mikroskop. Füllen Sie eine Spritze mit entionisiertem Wasser und befestigen Sie dann eine 23-Gauge-Nadel und ein langes Stück eines 1 x 16 Zoll großen Schlauchs mit einem hohlen, gebogenen Stahlstift. Füllen Sie den Schlauch mit entionisiertem Wasser aus der Spritze und stecken Sie den Stahlstift in das gestanzte Loch des Ventileinlasses, um den Schlauch zu verbinden. Entfernen Sie die Spritze und die Nadel, bevor Sie den Schlauch an den Off-Chip-Magneten anbringen. Schalten Sie mit der Bildgebungssoftware das Magnetventil ein und setzen Sie das Gerät einige Minuten lang unter Druck, um die gesamte Luft aus dem Ventil auszustoßen. Überprüfen Sie den Abschluss, indem Sie visuell überprüfen, ob die Luft-Wasser-Grenzfläche dunkel erscheint und im PDMS-Material verschwindet. Schalten Sie das Magnetventil mit der Bildgebungssoftware aus. Füllen Sie als Nächstes eine Ein-Milliliter-Spritze mit der gefilterten Bakterienlösung und befestigen Sie eine 30-Gauge-Nadel und ein langes Stück eines 1 x 32 Zoll großen Schlauchs an der Nadel. Drücken Sie auf den Kolben, um sowohl die Nadel als auch den angeschlossenen Schlauch mit der Bakterienlösung zu füllen. Führen Sie dann mit einer Pinzette den 1 x 32 Zoll großen Schlauch direkt in den Nahrungseinlass des mikrofluidischen Geräts ein und platzieren Sie die Spritze auf der Spritzenpumpe. Drücken Sie den Spritzenkolben mit der Rändelschraube auf der Rückseite, um das Gerät mit Flüssigkeit zu füllen. Blockieren Sie sowohl den Einlass als auch den Auslass der Schnecke mit abgedichteten Stahlstiften und üben Sie mit der Stellschraube zusätzlichen Druck aus, um die verbleibende Luft aus dem Gerät zu entfernen. Entfernen Sie dann den blockierten Stahlstift am Auslauf und befestigen Sie den Abfallbehälter am Auslauf. Drücken Sie auf die Spritze, um sicherzustellen, dass der Abfallbehälter richtig angeschlossen ist und keine Verstopfungen im System vorhanden sind. Entfernen Sie den zweiten blockierten Stahlstift aus dem Einlass und drücken Sie die Spritze, bis ein kleiner Flüssigkeitstropfen am Wurmeinlass erscheint. Befestigen Sie dann mit einer 23-Gauge-Nadel ein längeres Stück eines 1 x 16 Zoll großen Schlauchs mit einer Größe von etwa 15 bis 20 Zentimetern an einer Ein-Milliliter-Spritze, die mit S-Basalpuffer gefüllt ist. Befestigen Sie einen geraden 23-Gauge-Stahlstift am anderen Ende des Schlauchs. Füllen Sie die Nadel und den Schlauch mit S-Basalpuffer aus der Spritze. Führe nun den Stahlstift am Ende des Schlauchs in das Rohr mit den Würmern ein und drücke eine kleine Menge Flüssigkeit durch den Schlauch, um sicherzustellen, dass keine Luft mehr übrig ist. Ziehen Sie die Würmer in den Schlauch, ohne sie in die Spritze zu ziehen. Schieben Sie dann die mit den Würmern verbundene Spritze, bis ein kleiner Flüssigkeitstropfen auf dem Stahlstift erscheint, und führen Sie den Stahlstift in den Wurmeinlass des mikrofluidischen Geräts ein. Stellen Sie das Gerät auf ein Mikroskop mit geringer Vergrößerung, entweder 5x oder 10x, oder auf ein Präpariermikroskop. Positionieren Sie das Gerät so, dass der Einlass auf einer Seite des Sichtfeldes sichtbar ist und auf der anderen Seite die Rückseite des Einlasses des Siphonkanals sichtbar ist. Drücke vorsichtig auf den Kolben der Wurmspritze. Schieben Sie als Nächstes die Tiere in Richtung des Kanalarrays. Sobald ein Tier dem Kanal zugewandt ist, schiebe es in den Kanal und wiederhole den Vorgang für weitere Tiere. Nachdem Sie genügend Tiere gefangen haben, legen Sie die Spritze, die noch am Wurmeinlass befestigt ist, auf den Mikroskoptisch, wo sie während des gesamten Experiments verbleibt. Wenn ein Präpariermikroskop geladen wurde, übertragen Sie das Gerät auf das bildgebende Mikroskop. Schalten Sie nun die Spritzenpumpe ein und lassen Sie sie mit einer voreingestellten Leistung von einem Mikroliter pro Stunde für 0,5 Mikroliter laufen. Programmieren Sie die Spritzenpumpe so, dass sie mit einem Mikroliter pro Stunde für 0,5 Mikroliter läuft, wonach die Durchflussrate für 0,5 Mikroliter um 100 Mikroliter pro Stunde erhöht wird und das Flussmuster während des gesamten Experiments wiederholt wird. Stellen Sie das Gerät auf den Mikroskoptisch und stellen Sie sicher, dass es fest gehalten wird. Wechseln Sie zur gewünschten Bildvergrößerung. Identifizieren Sie die Tiere und Regionen von Interesse innerhalb des Fallenkanal-Arrays und richten Sie die gewünschten Bildgebungsbedingungen ein. Nehmen Sie das Bild unter den gewünschten Bildgebungsbedingungen auf, indem Sie das On-Chip-Ventil 10 Sekunden vor der Bildaufnahme durch den Magneten betätigen, damit die Tiere an Ort und Stelle gehalten werden. Das mikrofluidische Gerät behielt aufgrund der Verwendung eines 170 Mikrometer dicken Deckglases eine hohe Bildgebungsqualität über verschiedene Mikroskopiemodalitäten bei, einschließlich Hellfeld-, Epifluoreszenz-, konfokale Spinning-Disc- und Super-Resolution-Methoden. Entwicklung von Caenorhabditis elegans-Epithelzellen vom frühen L1-Larvenstadium bis zum mittleren L2-Larvenstadium visualisiert. Die Induktion der primären verblassten Vulva-Vorläuferzellen und deren anschließende Teilung vom späten L1- bis zum frühen L4-Larvenstadium war offensichtlich. Die Vulva-Entstehungsstadien reichen vom frühen L3 bis zum Erwachsenenalter. Die aufgenommenen Bilder wurden durch Bildentfaltung und -registrierung verbessert, wodurch die visuelle Klarheit verbessert wurde. Die beobachteten Zellteilungen erfolgten bei allen Tieren konsistent und rechtzeitig, wobei alle Teilungen innerhalb der typischen Larvenstadien abgeschlossen wurden. Die Länge der Gonade nahm während der L2- und L3-Stadien stetig zu, wobei konsistente Messungen durch die gerade Ausrichtung der Tiere ermöglicht wurden.