Im lebenden Organismus Anwendung der TurboID-basierten Proximity-Markierung bei Drosophila melanogaster

In dieser Studie wird TurboID-basiertes Proximity-Labeling verwendet, um die Wechselwirkungen von Zucchiniproteinen in den Keimbahnzellen des Drosophila-Eierstocks zu kartieren. Es wurden sowohl bekannte als auch neue Wechselwirkungen der Zucchini identifiziert. Insbesondere wurde festgestellt, dass mehrere neuartige Interaktoren an der Proteinfaltung, der Membranorganisation und dem physischen Transport beteiligt sind. In dieser Studie wird TurboID für eine effektive Markierung in tierischem Gewebe bei gleichzeitiger Kontrolle der Hintergrundbiotinylierung verwendet. Die Markierungsspezifität und die Proteinabdeckung werden durch die Optimierung der Kontrollen und die Anreicherung biotinylierter Peptide nach der Trypsinisierung verbessert. Dieser Ansatz ermöglicht ein systemisches Screening von Proteininteraktionen, um die Funktionen und molekularen Mechanismen von Proteinen von Interesse aufzudecken.

[Erzähler] Tragen Sie zunächst einen Laborlöffel glatte Hefepaste, die durch Auflösen von Hefepulver in dreifach destilliertem Wasser hergestellt wurde, auf die Wand eines Fläschchens auf. Nimm ein weiteres Fläschchen mit frisch geschlüpften Fliegen und klopfe vorsichtig darauf, um die Fliegen am Boden einzusammeln. Drehen Sie dieses Fläschchen auf das Fläschchen mit der Hefepaste um und richten Sie die Ränder aus, um ein Entweichen von Fliegen zu verhindern. Klopfen Sie beide Fläschchen zusammen, um die Fliegen in den unteren Teil des Fläschchens mit der Paste zu übertragen. Sobald die Übertragung abgeschlossen ist, setzen Sie die Wattestärkchen sicher auf beide Fläschchen und warten Sie drei Tage lang. Am dritten Tag werden 100 mikromolare Biotin-Arbeitslösung hergestellt, indem eine molare Biotinbrühe in dreifach destilliertem Wasser verdünnt wird. Geben Sie 500 Mikroliter 0,5% Proponsäure in die Lösung. Die Biotinlösung mit Trockenhefepulver vermischen und zu einer Paste verrühren. Geben Sie einen Laborlöffel Biotin-Hefepaste an die Wand eines Biotin-Lebensmittelfläschchens. Teilen Sie die Fliegen in zwei Gruppen ein. Eine Gruppe als Kontrolle in ein Fläschchen mit normalem Futter umfüllen. Übertragen Sie die andere Gruppe in ein Biotin-Lebensmittelfläschchen, das mit Biotin-Hefepaste ergänzt ist, um das Biotin-Hochgefühl zu beginnen. Füllen Sie die Fliegen nach 16 Stunden in ein neues Fläschchen mit normalem Futter um. Für die Entnahme von Drosophila-Eierstöcken pipettieren Sie einen Milliliter kaltes Grace's Insect Medium auf die Sezierschale. Legen Sie mit einer Pinzette mit feiner Spitze eine weibliche Fliege in die Sezierschale und tauchen Sie sie in das Medium. Halten Sie den Thorax mit einer Pinzette, ohne den Körper zu zerquetschen. Verwenden Sie eine andere Pinzette, um die Spitze des hinteren Bauches, an der sich die Genitalien befinden, vorsichtig zu entfernen. Drücken Sie die Eierstöcke langsam mit der Pinzette heraus, beginnend am Oberbauch und nach unten. Entfernen Sie Muskelnetze und umliegendes Gewebe, ohne die Eierstöcke zu beschädigen. Übertragen Sie die sauberen Eierstöcke mit einer Pinzette in ein 1,7-Milliliter-Röhrchen und halten Sie das Röhrchen auf Eis. Für die Gewebelyse geben Sie 500 Mikroliter 2%iges Natriumdodecylsulfat in trys gepufferter Kochsalzlösung, die mit einem Proteasehemmer-Cocktail ergänzt ist, in das Röhrchen mit den Eierstöcken. Warten Sie, bis die Zellen lysiert sind und die Lösung klebrig wird. Führen Sie die Beschallung unter den auf dem Bildschirm angezeigten Bedingungen durch. Als nächstes überträgst du das Lysat für die Acetonfällung in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen mit niedriger Bindung. Geben Sie kaltes Aceton mit dem Sechsfachen des Probenvolumens in das Röhrchen. Drehen Sie das Röhrchen kurz ein, laden Sie es dann in einen Multirotator und inkubieren Sie es über Nacht für etwa 16 Stunden bei minus 20 Grad Celsius. Pelletieren Sie die gefällten Proteine, indem Sie sie 15 Minuten lang bei 15.000 g bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Fügen Sie nun zwei Milliliter einer Mischlösung hinzu, die zu 90 % aus kaltem Aceton und zu 10 % aus gepufferter Kochsalzlösung besteht. Mischen Sie das Pellet und die Lösung, indem Sie es in einer Auf- und Ab-Bewegung pipettieren. Wirbeln Sie das Röhrchen kurz vor, bevor Sie es wieder in den Multirotator laden und zwei Stunden lang bei minus 20 Grad Celsius inkubieren. Pelletieren Sie die gefällten Proteine, indem Sie sie 15 Minuten lang bei 15.000 g bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nachdem Sie den Überstand abgelegt haben, drehen Sie sich bei vier Grad Celsius. Öffnen Sie dann die Tube und lassen Sie das Pellet 10 Minuten an der Luft trocknen. Suspendieren Sie das Proteinpellet in 500 Mikrolitern achtmolaren Harnstoff. Übertragen Sie die Lösung in ein ein Milliliter großes Milliröhrchen, das adaptive fokussierte Akustik oder AFA-Fasern enthält. Beschallen Sie das Röhrchen mit den gleichen Parametern, die zuvor gezeigt wurden, bevor Sie eine Bicinchoninsäure (BCASA) durchführen, um die Proteinkonzentration zu bestimmen. Denaturieren Sie die Proteine mit einem Thermoblock, der eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius auf 450 U/min eingestellt ist. Geben Sie fünf Mikroliter eines molaren Dithiothreitols, gelöst in dreifach destilliertem Wasser, in das Röhrchen, um eine Endkonzentration von 10 Millimolar zu erreichen. Lege das Röhrchen wieder für eine Stunde bei 37 Grad Celsius auf den Thermoblock, um die Proteine zu reduzieren. Geben Sie nun 55 Mikroliter 400 millimolare Jodacetamidlösung in das Probenröhrchen, um eine Endkonzentration von 40 Millimolaren zu erreichen, bevor Sie das Röhrchen zur Alkylierung wieder in den Thermoblock legen. Die Probe wird durch Zugabe von 50 millimolaren Ammoniumbicarbonatlösung verdünnt, bis das Gesamtvolumen vier Milliliter erreicht. Geben Sie vier Mikroliter einer molaren Calciumchlorid-Stammlösung in das Röhrchen, um eine Endkonzentration von einem Millimolar zu erreichen. Pipettieren Sie auf und ab, um die Lösung zu homogenisieren. Geben Sie als nächstes 150 Mikroliter eines Milligramms pro Milliliter Trypsin-Stammlösung in das Röhrchen und halten Sie dabei ein Verhältnis von Trypsin zu Probe von eins zu 20 aufrecht. Verdauen Sie das Protein mit einem Thermoblock, der 16 Stunden lang bei 37 Grad Celsius auf 450 U/min eingestellt ist. Waschen Sie 150 Mikroliter konjugierte magnetische Streptavidin-Kügelchen pro drei Milligramm Probe mit einem Milliliter zweimolaren Harnstoff in trys gepufferter Kochsalzlösung. Pipettieren Sie einen Milliliter der verdauten Peptide in das Röhrchen mit den Kügelchen und mischen Sie es vorsichtig. Kombinieren Sie die Mischung mit der restlichen Peptidprobe in einem Fünf-Milliliter-Röhrchen mit geringer Bindung. Nach einer Stunde Inkubation einen Milliliter der Mischung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen umfüllen und eine Minute lang auf ein Magnetgestell stellen. Waschen Sie die Kügelchen zweimal mit einem Milliliter zweimolaren Harnstoff in 50 Millimolar Ammoniumbicarbonat und einmal mit einem Milliliter dreifach destilliertem Wasser, bevor Sie das Röhrchen wieder für eine weitere Minute auf das Magnetgestell legen und den Puffer entsorgen. Als nächstes pipettieren Sie 100 Mikroliter des elucianischen Puffers in das Kügelchen, das das Röhrchen enthält, mischen vorsichtig und eluieren die Peptide mit einem Thermoblock, der auf 300 U/min eingestellt ist, für fünf Minuten bei 60 Grad Celsius, bevor Sie das Röhrchen wieder auf das Magnetgestell stellen. Übertragen Sie nun das Elue in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen, wobei Sie jegliche Beads vermeiden müssen. Die eluierte Probe ist nun bereit, getrocknet und für die massenspektrometrische Analyse verwendet zu werden. Diese Abbildung zeigt die konfokale Bildgebung und die proteomische Interaktionsanalyse von Zucchini V5 TurboID zur Identifizierung proximaler und interagierender Proteine. Konfokale Bilder zeigten eine starke überlappende Expression zwischen Transgenen und proximalen Proteinen nach einer Biotin-Fütterungsbehandlung, wie sie mit dem V5-Antikörper bzw. dem Streptavidin-konjugierten Alexa Fluer 594 eingefangen wurde. Die genontologische Analyse des Zucchini-V5-TurboID-Proteoms zeigte angereicherte biotinylierte Proteine, die an der Chaperon-vermittelten Proteinfaltung, der Organisation des Endomembransystems und der Regulation des Transports vom endoplasmatischen Retikulum zum GGI-Apparat beteiligt sind.