Name: Im lebenden Organismus Anwendung der TurboID-basierten Proximity-Markierung bei Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Lernen Sie TurboID-basierte Proximity-Labeling zur Kartierung von Proteininteraktionen in Drosophila melanogaster Keimzellen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung neuer Interaktoren für Entwicklungsbiologie.

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<ol><li>Kim, D. I., Roux, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filling+the+void%3A+Proximity-based+labeling+of+proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Filling the void: Proximity-based labeling of proteins in living cells.</a> Trend Cell Biol. 26 (11), 804-817 (2016).</li>
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<li>Uckun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+profiling+of+the+alk+proximitome+in+the+developing+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo profiling of the alk proximitome in the developing Drosophila brain.</a> J Mol Biol. 433 (23), 167282(2021).</li>
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<li>Artan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactome+analysis+of+Caenorhabditis+elegans+synapses+by+turboid-based+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interactome analysis of Caenorhabditis elegans synapses by turboid-based proximity labeling.</a> J Biol Chem. 297 (3), 101094(2021).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turboid-based+proximity+labeling+reveals+that+ubr7+is+a+regulator+of+n+nlr+immune+receptor-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Turboid-based proximity labeling reveals that ubr7 is a regulator of n nlr immune receptor-mediated immunity.</a> Nat Comm. 10 (1), 3252(2019).</li>
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<table><tbody><tr><td>Antikörper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Maus IgG (H+L) Sekundärantikörper, HRP</td><td>Invitrogen</td><td>31430</td><td>Analytischer, lichtempfindlicher</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L) hoch kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor plus 488</td><td>Invitrogen</td><td>A32731</td><td>Analytischer, lichtempfindlicher</td></tr><tr><td>Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Sekundärantikörper, HRP</td><td>Invitrogen</td><td>31460</td><td>Lichtempfindlicher</td></tr><tr><td>HSP90-Antikörper in analytischer Qualität (Kaninchen)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4874</td><td>Polyklonaler Antikörper</td></tr><tr><td>Pierce Streptavidin-Protein, HRP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21126</td> Streptavidin <td>in analytischer Qualität</td></tr><tr><td>, Alexa Fluor 594-Konjugat</td><td>Invitrogen</td><td>S11227</td><td>Lichtempfindlicher, analytischer</td></tr> <tr><td>AntikörperV5-Tag-Antikörper (Maus)</td><td>Invitrogen</td><td>R960-25</td><td>Monoklonaler Antikörper</td></tr><tr><td>V5-Tag-Antikörper (Kaninchen) (D3H8Q)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>13202</td><td>Monoklonaler Antikörper</td></tr><tr><td>Fly Lines</td><td>Company<</td><td>strong>Katalognummer</td><td>Kommentare/Beschreibung</td></tr><tr><td>pUASp Tom20 V5-TurboID/ TM3</td><td>Korea Drosophila Stock Center</td><td>2373-2</td><td>Fliegenmaterial</td></tr><tr><td>pUASp Zucchini V5-TurboID/Cyo</td><td>Korea Drosophila Stock Center</td><td>2188</td><td>Fly Material</td></tr><tr><td>pUASP_attB_V5-TurboID-NES/Cyo</td><td>Korea Drosophila Stock Center</td><td>2635-4</td><td>Fliegenmaterial</td></tr><tr><td>mit [*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2H</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>7062</td><td>Fly stock</td></tr><tr><td>Equipments and Contakeables</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>strong><Kommentare/Beschreibung</td></tr><tr><td>Analysenwaage</td><td>Mettler Toledo</td><td>ME204</td><td>0,1 mg Lesbarkeit</td></tr><tr><td>Amersham Protran 0,45 NC Nitrozellulose Western Blotting Membranen (300 mm & 4 m)</td><td>Cytiva</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>10600002-Axygen 1,7 mL MaxyClear Snaplock Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>MCT-175-C</td><td>Co-Polymer</td></tr><tr><td>MARKE&nbsp; Deckglas (22 mm x 22 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR470055</td><td>Borosilikatglas</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen (10 & Mikro; L)</td><td>Vertex</td><td>4110N00</td><td>Propylen-Pipettenspitzen</td></tr><tr><td>(1000 & Mikro; L)</td><td>Vertex</td><td>4330N00</td><td>Propylen-Pipettenspitzen</td></tr><tr><td>(200 & Mikro; L)</td><td>Vertex</td><td>4230N00</td><td>Propylen-Zellkulturplatte</td></tr><tr><td>(96 Well)</td><td>SPL</td><td>300096</td><td>Zentrifuge aus Polystyrol</td></tr><tr><td>mit flachem Boden (mit 1,5-2 mL röhrchengroßem Rotor)</td><td>Eppendorf</td><td>5424 R</td><td></td></tr><tr><td>Kühlzentrifuge mit festem Winkel (mit 5 mL röhrchengroßem Rotor)</td><td>Eppendorf</td><td>5425 R</td> Gekühlter Chemikalienlöffel mit <td>festem Winkel</td></tr> <tr><td></td><td>-</td><td>- </td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Bildgebungssystem</td><td>aus Edelstahl Biorad</td><td>12003153</td><td>Western-Blot-Bildgebungssystem</td></tr><tr><td>CO2 Fliegenpad</td> <td>-</td><td></td> <td>Anästhesieplatte</td></tr><tr><td>CO2 Tank und Atemregler</td><td></td> <td>-</td> <td>Vorsicht vor Hochdruckgas und Schwindel</td></tr><tr><td>Kompakter Inkubator</td><td>JSR</td><td>JSGI-10T</td><td>Vorsicht vor hoher Temperatur Temperatur</td></tr><tr><td>Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710</td><td>Vorsicht vor intensivem Laserstrahl</td></tr><tr><td>Konisches Rohr (15 mL)</td><td>SPL</td><td>50015</td><td>Polypropylen /Polyethylen hoher Dichte&nbsp;</td></tr><tr><td>Konisches Röhrchen (50 mL)</td><td>SPL</td><td>50050</td><td>Polypropylen /Polyethylen hoher Dichte&nbsp;</td></tr><tr><td>Digitale Waage</td> <td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr> <tr><td>Digitaler Timer</td> <td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr> <tr><td>Dissektionsschale</td> <td>-</td><td>-</td><td>Silikon</td></tr><tr><td>Dumont #5SF Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Superfeine Spitzen, Vorsicht vor scharfen Objekten</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Für Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Größe von 1,5-2 ml</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Objektträger (25 mm x 75 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Vorsicht vor scharfen</td></tr><tr><td>Gegenständen Fliegenfutterflaschen (mit Papierstopfen)</td><td>Hansol Tech</td><td>FFB-21010-Fläschchen</td><td></td></tr> <tr><td>mit Fliegenfutter (mit Wattekappe)</td><td>Hansol Tech</td><td>FFV-11010-Fokussierter-Ultraschallgerät</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Covaris</td><td>M220</td><td>Vorsicht vor Ultraschallwellen</td></tr><tr><td>Gelmesser</td><td>Invitrogen</td><td>EI9010</td><td>Edelstahl mit Kunststoffgriff</td></tr><tr><td>Güteklasse 3MM Chr Löschpapier (46 cm & mal 57 cm)</td><td>Cytiva</td><td>3030-917</td><td>Whatmann Papier</td></tr><tr><td>Handheld Homogenisator und Kunststoffstößel</td><td>Kimble</td><td>749540-0000</td><td>Akku-Motor</td></tr><tr><td>Heizblock</td><td>Fein-PCR</td><td>ALB6400</td><td>Vorsicht bei hohen Temperaturen</td></tr><tr><td>Fusselfreies Taschentuch</td><td>Yuhan-Kimberly</td><td>41112</td><td>- </td></tr><tr><td>Flüssiger Stickstoff</td><td></td> <td>-</td> <td>Vorsicht vor Erfrierungen und Verbrennungen</td></tr><tr><td>Mikrotiterplatten-Spektralphotometer</td><td>Agilent Technologies</td><td>Epoch</td><td>Monochromator-basierte Optik</td></tr><tr><td>Mikrowelle</td> <td>-</td> <td>Vorsicht vor Hochtemperatur-MilliTUBE</td><td></td></tr> <tr><td>1 mL AFA-Faser</td><td>Covaris</td><td>PN 520135</td><td>Glas</td></tr><tr><td>Mini-Gel-Tank</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25977</td><td>Vorsicht bei</td></tr><tr><td>Hochtemperatur-NuPAGE Bis-tris Mini-Protein-Gelen, 4&ndash; 12%, 1,0&ndash; 1,5 mm, 10-Well-Invitrogen-NP0323BOX</td><td></td><td></td><td>enthalten Polyacrylamid, Vorsicht vor Toxizität</td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-tris Mini-Protein-Gele, 4&ndash; 12%, 1,0&ndash; 1,5 mm, 15-Well-Invitrogen</td><td></td><td>NP0321BOX</td><td>Enthält Polyacrylamid, Vorsicht vor Toxizität</td></tr><tr><td>Pinsel (& Oslash; 1,8 mm)</td><td>Hwa hong</td><td>791240-Pipetman</td><td></td></tr> <tr><td>L (P1000L)</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td>Einkanal-Mikropipette mit Metallabwerfer</td></tr><tr><td>Pipetman L (P200L)</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td>Einkanal-Mikropipette mit Metallabwerfer</td></tr><tr><td>Pipetman L ( P20L)</td><td>Gilson</td><td>FA10003M</td><td>Einkanal-Mikropipette mit Metall-Ejektor</td></tr><tr><td>Pipetman L (P2L)</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td>Einkanal-Mikropipette mit Metall-Ejektor</td></tr><tr><td>Stromversorgung</td><td>Major science</td><td>MP-310</td><td>Vorsicht vor Hochspannungselektrizität</td></tr><tr><td>Programmierbarer Rotator</td><td>Biosan</td><td>RS-24-Protein</td><td></td></tr> <tr><td>LoBind&nbsp; Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>30108302-Rasierklinge</td><td>Dorco</td><td>304020</td><td>Edelstahl, Vorsicht vor scharfen Gegenständen</td></tr><tr><td>Rolle</td><td>-</td><td>-</td><td>-Serologische</td></tr> <tr><td>Pipette (10 mL)</td><td>SPL</td><td>91010</td><td>Polystyrol</td></tr><tr><td>Serologische Pipette (25 mL)</td><td>SPL</td><td>91025</td><td>Serologische Polystyrolpipette</td></tr><tr><td>(5 mL)</td><td>SPL</td><td>91005</td> Serologische Pipette <td>aus Polystyrol</td></tr><tr><td>(50 mL)</td><td>SPL</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen aus Polystyrol mit Schnappverschluss und geringer Retention (1,5 mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>3451PK</td><td>Polypropylen-Schwammpad</td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>EI9052-Stereomikroskop</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508-Stereomikroskop</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoMischer&nbsp; C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Mit 1,5 & 5 mL großen Blöcken</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Aven Tools</td><td>18526</td><td>Kunststoff, flache Spitzen</td></tr><tr><td>Vortex-Mischer</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236-XCell</td><td></td></tr> <tr><td>II Blot-Modul</td><td>Invitrogen</td><td>EI9051</td><td>Vorsicht bei hohen Temperaturen</td></tr><tr><td>XCell&nbsp; SureLock Mini-Zelle</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td>Vorsicht vor</td></tr> <tr><td>hohen TemperaturenChemikalien</td><td>Company</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare/Beschreibung</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td><td>Analytische</td></tr><tr><td>Qualität Acetonitril</td><td>Supelco</td><td>1.00029.1000</td><td>LC-MS-Qualität, Vorsicht vor Inhalationstoxizität und brennbaren</td></tr><tr><td>Albumin-Standardampullen (mit Rinderserumalbumin (BSA) in einer Menge von 2 mg/ml in 0,9 % Kochsalzlösung und 0,05 % Natriumazid)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23209</td><td>Teil der Pierce BCA Protein Assay Kits (Thermo Scientific, 23225)</td></tr><tr><td>Albumin, Rinderserum</td><td>Bioshop</td><td>ALB001</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonat</td> in analytischer Qualität <td>Sigma-Aldrich</td><td>09830</td><td>Biotin in analytischer Qualität</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td> Calciumchlorid in <td>Zell- und Gewebekulturqualität</td></tr><tr><td>(CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td> Clarty Western <td>ECL-Substrat in Zellkulturqualität</td></tr><tr><td></td><td>Biorad</td><td>1705060</td> DAPI in <td>analytischer Qualität</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MBD0015</td><td>Lichtempfindliches, analytisches</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td> in analytischer Qualität <td>Corning</td><td>35-015-CV</td> Ameisensäure <td>in Zellkulturqualität</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507</td><td>Reagenzqualität, Vorsicht vor Inhalationstoxizität</td></tr><tr><td>Grace's Insektenmedium</td><td>Gibco</td><td>11595030</td><td>Zellkulturqualität</td></tr><tr><td>Instant-Trockenhefe</td><td>Keine Marke</td><td>N1019</td><td>-</td></tr><tr><td>Iodacetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td>Lichtempfindliches Methanol in analytischer Qualität</td></tr><tr><td></td><td>Carlo Erba</td><td>41484</td><td></td></tr><tr><td>Nagellack</td><td></td> in analytischer Qualität <td>-</td> <td>Clear-Type</td></tr><tr><td>Novex Tris-glycin SDS-Probenpuffer (2X)</td><td>Invitrogen</td><td>LC2676</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Laufpuffer in analytischer Qualität (20X)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Vorgefärbte Proteinleiter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td>Analytische Qualität</td></tr><tr><td>Phenylmethansulfonylfluorid&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer-Kochsalzlösung</td> in analytischer Qualität <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Analytische</td></tr><tr><td>Qualität Pierce 16 % Formaldehyd (w/v)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td> Lichtempfindliche Pierce BCA-Protein-Assay-Kits in <td>analytischer Qualität</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>Analytische Qualität</td></tr><tr><td>Pierce BCA Reagenz A (enthält Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Bicinchoninsäure und Natriumtartrat in 0,1 M Natriumhydroxid)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23228</td><td>Teil der Pierce BCA Protein Assay Kits (Thermo Scientific, 23225)</td></tr><tr><td>Pierce BCA Reagenz B (enthält 4 % Kupfersulfat)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1859078</td><td>Teil der Pierce BCA Protein Assay Kits (Thermo Scientific, 23225)</td></tr><tr><td>Propionsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402907</td><td>ACS-Qualität</td></tr><tr><td>Proteaseinhibitor-Cocktail-Set III</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td> Zell- <td>und Gewebekulturqualität</td></tr><tr><td>SlowFade Gold Antifade Eindeckmittel</td><td>Invitrogen</td><td>S36936</td><td>Lichtempfindliches</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Bioneer</td><td>C-9025</td> Natriumdesoxycholat <td>in analytischer Qualität</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>Analytische Qualität</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid (NaOH)</td> in molekularer Qualität <td>Biosesang</td><td>SR2018-100-00</td><td>Analytische Qualität</td></tr><tr><td>Dreifach destilliertes Wasser</td><td></td> <td>-</td> <td>Ultrarein (Typ 1)</td></tr> <tr><td>Tris-gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94158</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycin-Transferpuffer</td> in analytischer Qualität <td>Koma Biotech</td><td>K0341001</td><td>Analytische Qualität</td></tr><tr><td>Tris-HCl, pH 8</td><td>Bioneer</td><td>C-9006</td><td>Analytische Qualität</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td>Molekulare Qualität</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20233</td><td>Zellkulturqualität</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td>Molekulare Qualität</td></tr><tr><td>Harnstoff</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378</td><td>Molekular & Zellkultur-Qualität</td></tr></tbody></table>

im lebenden organismus anwendung der turboid-basierten proximity-markierung bei drosophila melanogaster

In Vivo Application of TurboID-based Proximity Labeling in Drosophila melanogaster

Beispielausgaben sind in Abbildung 1 dargestellt, Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4 wurden zuvor von Nguyen et al.20 veröffentlicht. Abbildung 1 veranschaulicht das experimentelle Verfahren der TurboID-basierten PL in Drosophila-Ovarien. Zunächst wurde ein Konstrukt generiert, das Zuc und TurboID kombinie...

Im lebenden Organismus Anwendung der TurboID-basierten Proximity-Markierung bei Drosophila melanogaster

Proximity labeling (PL) is a powerful method for mapping protein-protein interaction networks. Advances in labeling enzymes, especially TurboID, have ...

in-vivo-application-turboid-based-proximity-labeling-drosophila

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Dieses Papier zeigt die Verwendung eines schnellen konfokalen Mikroskop, um Bildzelle Verhalten direkt durch die Puppenhülle. Nach dem Verlassen der Puppenhülle intakt ist, erlaubt dieses Verfahren die Beobachtung und Messung von dynamischen Zellprozesse im Stadium der Drosophila-Entwicklung, die schwer direkt zu studieren.

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Dieses Protokoll stellt eine effiziente Methode zur Bildgebung des lebenden Neuroepithels des Puppenaugen von Drosophila dar. Diese Methode kompensiert Gewebebewegungen und ungleichmäßige Topologie, verbessert die Visualisierung von Zellgrenzen durch die Verwendung mehrerer GFP-markierter Verbindungsproteine und verwendet ein einfach zu montierendes Bildgebungsgerät.

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Visualisierung des zytoskelettabhängigen Handels von lipidhaltigen Organellen in Drosophila-Embryonen

Lernen Sie TurboID-basierte Proximity-Labeling zur Kartierung von Proteininteraktionen in Drosophila melanogaster Keimzellen. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung neuer Interaktoren für Entwicklungsbiologie.

Im lebenden Organismus Anwendung der TurboID-basierten Proximity-Markierung bei Drosophila melanogaster

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