Name: Validierter immunchemischer Assay zur umfassenden Bestimmung des humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors 2, der aus Zellen freigesetzt und an Zellen gebunden wird (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Erfahren Sie die validierte Sandwich-ELISA-Methode zur präzisen Quantifizierung von zellgebundenem und freigesetztem HER2-Protein. Diese Technik unterstützt Diagnostik und Krebsforschung mit zuverlässigen Ergebnissen.

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1. Kultivierung menschlicher Krebszellen
<ol><li>Kultivieren Sie MDA-MB-231-, SK-BR-3- und SK-OV-3-Linien in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, das 4,5 g/l ᴅ-Glucose (DMEM-HG) enthält, ergänzt mit 2 mM ʟ-Glutamin und 10 % (v/v) hitzeinaktiviertem FBS. Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2.</li>
	<li>Wenn die Kultur ~80% Konfluenz erreicht, lösen Sie die Zellen durch Trypsinisierung ab und sammeln Sie sie in separaten konischen 15-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzähler und die Samenzellen für das Experiment in 12-Well-Platten mit einer Dichte von 3 × 105 Zellen/pro Well in 1 ml Wachstumsmedium. Inkubieren Sie die Kulturen bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2. HINWEIS: Säen Sie eine Vertiefung pro Zeitpunkt des Experiments. Sowohl Nachkulturmedium als auch Zelllysate werden in der weiteren Analyse verwendet.</li>
</ol>2. Probenentnahme und -vorbereitung
<ol><li>Sammeln Sie das Kulturmedium aus der 24-Stunden-Kultur aus einer Vertiefung jeder Zelllinie in ein 1,5-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Die entnommenen Proben werden bei 10 000 × g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Den Überstand in ein neues Röhrchen umfüllen und bei -20 °C lagern, um den sezernierten ECD-HER2-Spiegel weiter zu bestimmen.</li>
	<li>Waschen Sie die restlichen Zellen auf der Platte mit 1 ml kaltem PBS, aspirieren Sie vorsichtig und entsorgen Sie das PBS.</li>
	<li>Geben Sie 200 μl RIPA-Puffer (ergänzt mit 1 % Proteaseinhibitor) in jede Vertiefung und inkubieren Sie 5 Minuten lang. Kratzen Sie die Zellen mit dem Zellschaber ab und mischen Sie durch mehrmaliges Pipettieren, um das Lysat zu homogenisieren.</li>
	<li>Sammeln Sie die lysierten Zellen in einem neuen Röhrchen und aspirieren Sie sie langsam mit einer Nadel in eine 2-ml-Spritze (G21 / 0,8 mm × 40 mm). Wiederholen Sie den Aspirationsschritt 5-10 Mal, um die Zellen weiter aufzulösen.</li>
	<li>Die entnommenen Proben werden bei 10 000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird in ein neues Röhrchen umgefüllt und bei -20 °C gelagert, um die zellgebundene Fraktion des HER2-Proteins weiter zu bestimmen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Entnahme von Kulturmedium und zellulärem Material und befolgen Sie die Vorbereitungsschritte für die verbleibenden Zeitpunkte - 48 h und 72 h Kultur.</li>
</ol>3. Durchführung eines Sandwich-ELISA zur HER2-Bestimmung
<ol><li>Bereiten Sie die Puffer vor.<ol><li>Überzugspuffer: 0,1 M NaHCO3-Lösung herstellen, indem 0,42 g NaHCO3 in 50 mL destilliertem Wasser gelöst und gründlich gemischt werden. Stellen Sie den pH-Wert mit 3 M NaOH auf 9,6 ein.</li>
		<li>Blockierungspuffer: Bereiten Sie 5 % fettfreie Milch (NFDM) in PBS vor, indem Sie 0,5 g Lotting-Milchpulver zu 10 ml PBS hinzufügen und gründlich mischen.</li>
		<li>Waschpuffer: Bereiten Sie phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit Tween 20 (PBST) vor, indem Sie 0,5 mL 0,05 % Tween-20 bis 1000 mL PBS hinzufügen und mischen (übermäßige Schaumbildung vermeiden).</li>
	</ol></li>
	<li>Biotinylat des nachweisbaren Antikörpers.<ol><li>Biotinylat 50-200 μg nachweisbarer Anti-HER2-Antikörper (Klon 70.21.73.67) unter Verwendung eines kommerziellen Biotin-Markierungskits gemäß den Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: Die Zuverlässigkeit und Wiederholbarkeit des Biotinylierungsprozesses basiert auf der Messung der endgültigen Proteinkonzentration des resultierenden Antikörpers und dem Chargenvergleich des Produkts.</li>
	</ol></li>
	<li>Bestreiche die Platte.<ol><li>Verdünnen Sie den Anti-HER2-Fängerantikörper (Klon 70.27.58) auf eine Konzentration von 1 μg/ml im Beschichtungspuffer. Um eine Platte zu beschichten, verwenden Sie 6,5 ml der einfangenden Antikörperlösung.</li>
		<li>Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl der in Schritt 3.3.1 hergestellten Auffangantikörperlösung in jede Vertiefung auf einer 96-Well-ELISA-Platte. HINWEIS: Vermeiden Sie die äußersten Vertiefungen der Platte (z. B. A1, H12), um die durch den Kanteneffekt verursachte Variabilität zu reduzieren. Die äußersten Vertiefungen sollten mit destilliertem Wasser gefüllt werden, um stabile Reaktionsbedingungen zu gewährleisten.</li>
		<li>Decken Sie die Platte mit einer Siegelfolie ab.</li>
		<li>Die Platte über Nacht (O/N) bei 4 °C inkubieren.</li>
		<li>Nach der O/N-Inkubation stellen Sie die Platte bei Raumtemperatur (RT) für 1 h auf einen horizontalen Mikroplattenschüttler (20-30 U/min mit einem Neigungswinkel von 4°-6°).</li>
		<li>Aspirieren Sie die Beschichtungslösung mit einem Mikroplattenwascher und waschen Sie die Platte dreimal mit einem Waschpuffer (3 x 300 μl PBST pro Well).</li>
	</ol></li>
	<li>Blockieren Sie die Platte .<ol><li>Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl Blockierungspuffer (5 % NFDM in PBS) in jede beschichtete Vertiefung, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren.</li>
		<li>Decken Sie die Platte mit einer Siegelfolie ab.</li>
		<li>Die Platte 1 h bei 37 °C in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren.</li>
		<li>Aspirieren Sie die Beschichtungslösung mit einem Mikroplattenwascher und waschen Sie die Platte dreimal mit einem Waschpuffer (3 x 300 μl PBST pro Well).</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie eine Kalibrierkurve und eine Positivkontrolle vor (Abbildung 2).<ol><li>Bereiten Sie die Arbeitsstandardlösung des HER2-Antigens vor, indem Sie 2 μl 1 mg/ml-Stammlösung zu einer 1998 μl PBS hinzufügen, um eine HER2-Konzentration von 0,001 mg/ml (1000 ng/ml) zu erhalten.</li>
		<li>Verdünnen Sie die Arbeitsstandardlösung (WSS), indem Sie 200 μl der Lösung zu 1800 μl PBS hinzufügen, um die Standardlösung 1 (STD 1) zu erhalten.</li>
		<li>Bereiten Sie die folgenden sechs Standards (STD 2-STD 7) durch serielle Verdünnung von STD 1 in PBS vor (Abbildung 2).<ol><li>STD 2: Fügen Sie 500 μl STD 1 bis 500 μl PBS hinzu und mischen Sie gründlich, um 50 ng/ml herzustellen.</li>
			<li>STD 3: 500 μl STD 2 bis 500 μl PBS hinzufügen und gründlich mischen, um 25 ng/ml herzustellen.</li>
			<li>STD 4: 500 μl STD 3 bis 500 μl PBS hinzufügen und gründlich mischen, um 12,5 ng/ml herzustellen.</li>
			<li>STD 5: 500 μl STD 4 bis 500 μl PBS hinzufügen und gründlich mischen, um 6,25 ng/ml herzustellen.</li>
			<li>STD 6: 500 μl STD 5 bis 500 μl PBS hinzufügen und gründlich mischen, um 3,125 ng/ml herzustellen.</li>
			<li>STD 7: 500 μl STD 6 bis 500 μl PBS zugeben und gründlich mischen, um 1,5625 ng/ml herzustellen.</li>
			<li>STD 8: Fügen Sie 500 μl PBS hinzu, um 0 ng/ml herzustellen.</li>
		</ol></li>
		<li>Positivkontrolle: Verdünnen Sie STD 1 durch Zugabe von 100 μl der STD 1-Lösung zu 900 μl PBS, um eine HER2-Lösung mit einer Proteinkonzentration von 10 ng/ml zu erhalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie Proben für Spike- und Wiederfindungsexperimente vor.<ol><li>Bereiten Sie die Matrixproben (PBS, Zelllysate und Kulturmedium) vor, die mit der bekannten HER2-Proteinkonzentration versetzt sind. Verdünnen Sie die Zelllysate im Verhältnis 1:2000 durch Zugabe von 2,5 μl des geeigneten Zelllysats zu 5 ml PBS, um eine Probenmatrix mit einem HER2-Spiegel unterhalb der LOD der Methode zu erhalten.</li>
		<li>Verwenden Sie WSS (1000 ng/ml) und STD1 (100 ng/ml), um Matrixproben zu spiken.</li>
		<li>Bereiten Sie für jede Matrix 6 Proben mit Konzentrationen von 0, 2, 5, 10, 30 und 50 ng/ml vor.</li>
		<li>Zur Herstellung von 0 ng/ml fügen Sie 400 μl PBS/Kulturmedium/Zelllysat hinzu.</li>
		<li>Zur Herstellung von 2 ng/ml werden 8 μl STD1 zu 392 μl PBS/Kulturmedium/Zelllysat hinzugefügt und gründlich gemischt.</li>
		<li>Zur Herstellung von 5 ng/ml werden 20 μl STD1 zu 380 μl PBS/Kulturmedium/Zelllysat hinzugefügt und gründlich gemischt.</li>
		<li>Um 10 ng/ml herzustellen, fügen Sie 4 μl WSS zu 396 μl PBS/Kulturmedium/Zelllysat hinzu und mischen Sie gründlich.</li>
		<li>Zur Herstellung von 30 ng/ml werden 12 μl WSS zu 388 μl PBS/Kulturmedium/Zelllysat hinzugefügt und gründlich gemischt.</li>
		<li>Um 50 ng/ml herzustellen, fügen Sie 20 μl WSS zu 380 μl PBS/Kulturmedium/Zelllysat hinzu und mischen Sie gründlich.</li>
	</ol></li>
	<li>Fügen Sie die Stichprobe, den Rohling und den Standard hinzu.<ol><li>Geben Sie mit einer Einkanalpipette 100 μl Standard-, Blind- (PBS) und getestete Proben (Zelllysate und Kulturmedium) in die entsprechenden Vertiefungen. HINWEIS: Es wird empfohlen, jede Probe in dreifacher Ausfertigung durchzuführen.</li>
		<li>Decken Sie die Platte mit einer Siegelfolie ab.</li>
		<li>Die Platte 1 h bei 37 °C in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren.</li>
		<li>Aspirieren Sie die Beschichtungslösung mit einem Mikroplattenwascher und waschen Sie die Platte dreimal mit einem Waschpuffer (3 x 300 μl PBST pro Well).</li>
	</ol></li>
	<li>Erkennen Sie die Antikörperbindung.<ol><li>Verdünnen Sie den biotinylierten Nachweisantikörper (Klon 70.21.73.67) in PBS auf eine Arbeitskonzentration von 1 μg/ml. Verwenden Sie für eine Platte 6,5 ml Nachweis-Antikörper-Arbeitslösung.</li>
		<li>Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl der Nachweis-Antikörper-Arbeitslösung in jede Vertiefung.</li>
		<li>Decken Sie die Platte mit einer Siegelfolie ab.</li>
		<li>Die Platte 1 h bei 37 °C in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren.</li>
		<li>Aspirieren Sie die Beschichtungslösung mit einem Mikroplattenwascher und waschen Sie die Platte dreimal mit einem Waschpuffer (3 x 300 μl PBST pro Well).</li>
	</ol></li>
	<li>Fügen Sie das Avidin-HRP-Konjugat hinzu.<ol><li>Verdünnen Sie das kommerziell erhältliche Avidin-HRP-Konjugat 1:40.000, indem Sie 1 μl enzymatisches Konjugat zu 40 ml PBST hinzufügen.</li>
		<li>Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl des verdünnten Konjugats in jede Vertiefung.</li>
		<li>Decken Sie die Platte mit einer Siegelfolie ab.</li>
		<li>Die Platte 1 h bei 37 °C in einer Feuchtigkeitskammer inkubieren.</li>
		<li>Aspirieren Sie die Beschichtungslösung mit einem Mikroplattenwascher und waschen Sie die Platte dreimal mit einem Waschpuffer (3 x 300 μl PBST pro Well).</li>
	</ol></li>
	<li>Kolorimetrische Reaktion<ol><li>Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl 3,3′,5,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB)-Substrat in jede Vertiefung.</li>
		<li>Decken Sie die Platte mit einer Siegelfolie ab.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Platte 1-5 min bei 37 °C lichtgeschützt und beobachten Sie die Farbentwicklung.</li>
		<li>Wenn die Farbe den erwarteten Wert erreicht, fügen Sie 100 μl Stopplösung hinzu, um die Reaktion zu beenden. HINWEIS: Der erwartete Gehalt entspricht einer intensiven blauen Färbung in Vertiefungen, die Proben mit einer hohen Konzentration des Analyten enthalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Erfassen und analysieren Sie Daten.<ol><li>Messen Sie die Extinktion bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader.</li>
		<li>Berechnen Sie anhand einer 4-parametrischen Kalibrierkurve die Probenkonzentration auf der Grundlage der Kurvengleichung.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68204/68204fig1v5.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des entwickelten Anti-HER2-Sandwich-ELISA-Workflows. Überblick über die wichtigsten Schritte des Sandwich-ELISA-Verfahrens. Dazu gehören die kritischen Schritte (mit einem roten Rahmen hervorgehoben) wie die Plattenbeschichtung mit dem einfangenden Anti-HER2-Antikörper 70.27.58, die Zugabe von Proben (Kurvenstandards, Blindproben, experimentelle Proben der Zelllysate oder des Kulturmediums) und die Bindung des detektierenden Anti-HER2-Antikörpers 70.21.73.67. Der Assay schließt mit der Signaldetektion und Datenanalyse ab, bei der das kolorimetrische Signal mit einem Mikroplatten-Reader quantifiziert wird, um die Konzentration des Zielantigens zu bestimmen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68204/68204fig1v5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68204/68204fig02.jpg"> Abbildung 2: Schema, das die Vorbereitung der Standardlösungen für die Kalibrierkurve darstellt. Serielle Verdünnungen des rekombinanten HER2-Proteins werden hergestellt, um eine Kalibrierkurve in einem Konzentrationsbereich von 1,56-100 ng/ml zu erzeugen (Fläschchen STD 1-STD 7). Zusätzlich ist die negative Kontrollprobe ohne das HER2-Protein enthalten (STD 8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68204/68204fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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<li>NinioMany, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR125a+induces+HER2+expression+and+sensitivity+to+trastuzumab+in+triplenegative+breast+cancer+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">miR125a induces HER2 expression and sensitivity to trastuzumab in triplenegative breast cancer lines.</a> Front Oncol. 10, 191(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Biotin Markierungskit-NH2</td><td>Abnova</td><td>KA0003</td><td></td></tr><tr><td>Blotting Grade, Milchpulver, fettarm</td><td>Roth</td><td>T145.1</td><td></td></tr><tr><td>Zellzählobjektträger für TC10/TC20 Zellzähler, Zweikammer</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturplatten</td><td>Biologix</td><td>07-6012</td><td></td></tr><tr><td>Zellschaber</td><td>Biologix</td><td>70-1250</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Ohaus</td><td>30130868</td><td></td></tr><tr><td>Klasse II Biologische Sicherheitswerkbank - Telstar Bio II Advance 6</td><td>Telstar</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platten mit klarem Flachboden</td><td>Thermo Fisher</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td>Culture Safe CO2 Inkubatoren - Touch 190S</td><td>Leec</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - hoher Glukosegehalt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0822</td><td></td></tr><tr><td>ELISA Plate Reader</td><td>BioTek</td><td>800TSUVI</td><td></td></tr><tr><td>FBS Standard, fötales Rinderserum</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-19375</td><td></td></tr><tr><td>Zwangsumlauftrockner für Labors</td><td>BINDER</td><td>9090-0018</td><td></td></tr><tr><td>HRP-Avidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>43-4423</td><td></td></tr><tr><td>Humanes Her2 / ErbB2 Protein, Fc Tag, Premium</td><td>Grade AcroBIOSYSTEMS</td><td>HER2-H5253</td><td></td></tr><tr><td>Immunowash Microplate Washer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-7009</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>solution Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>mAb a-HER2 (Klon 70.21.73.67)</td><td>SDS Optic</td><td>BIO-ABH-2</td><td></td></tr><tr><td>mAb a-HER2 (Klon 70.27.58)</td><td>SDS Optic</td><td>BIO-ABH-1</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>POCH</td><td>810530115</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>POCH</td><td>BA0981118</td><td></td></tr><tr><td>Protease-Inhibitor-Cocktail</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>RIPA-Puffer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>ROTI Fair PBS</td><td>Roth</td><td>1111.2</td><td></td></tr><tr><td>SK-BR-3 [SKBR3] Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td></td></tr><tr><td>SK-OV-3 [SKOV-3; SKOV3] Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td></td></tr><tr><td>Stopplösung 1x</td><td>Abcam</td><td>ab210900</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automatisierter Zellzähler</td><td>Bio-rad</td><td>1450102 TMB-Substrat</td><td></td></tr><tr><td>1x</td><td>Abcam</td><td>ab210902</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Ohaus</td><td>30392117</td><td></td></tr><tr><td>Wave Motion Shaker</td><td>Ohaus</td><td>30391968</td><td></td></tr></tbody></table>

validierter immunchemischer assay zur umfassenden bestimmung des humanen epidermalen wachstumsfaktor-rezeptors 2, der aus zellen freigesetzt und an zellen gebunden wird

Validated Immunochemical Assay for Comprehensive Determination of the Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 Released from and Bound to Cells

Sandwich-ELISA-Validierung Der neu entwickelte Assay erfordert ein Validierungsverfahren. Zu den wichtigen Validierungsparametern gehören Linearität, Präzision und Nachweisgrenzen, d. h. die untere Nachweisgrenze (LLOD) und die obere Nachweisgrenze. In der vorherigen Arbeit haben wir eine gründliche Methodenvalidierung durchgeführt. Die ELISA-Linearität wurde getestet, indem die simulierten Proben auf niedrige (2, 5, 10 ng/ml), mittlere bis hohe (30 ng/ml) und signifikant (50 ng/ml) Konzentrationen de...

Validierter immunchemischer Assay zur umfassenden Bestimmung des humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors 2, der aus Zellen freigesetzt und an Zellen gebunden wird

Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) is a well-established cancer marker. It became a very successful diagnostic and therapeutic target, ...

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Die Chromfreisetzungsassay eine gemeinsame Assay zum Nachweis zytotoxischer T-Zell-Aktivität, hat einige Einschränkungen. Mit Antigen-spezifischen CD8-T-Zellen und menschlichen Mammakarzinom Tumorzelllinie, SKBR3, die in diesem Artikel wurde ein Impedanz-Ansatz für die Fähigkeit des Erfassens Zelltötung untersucht.

Bestimmung der optimalen zytotoxische Aktivität der Menschenrechte Her2neu spezifischen CD8 T-Zellen durch Vergleich der Cr51 Freisetzungsassay dem xCELLigence-System

In den letzten Jahren wurden mit lebenden Zellen basierende Tests erfolgreich verwendet worden, um Antikörper gegen Oberflächenantigene erkennen und Konformationsänderungen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie ermöglicht die Analyse von großen Kohorten von Patienten. Detektion von neuen Antikörper Diagnose und Behandlung von Autoimmunerkrankungen zu verbessern.

Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect

Dieses Protokoll beschreibt die Markierung des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (EGFR) auf COS7-Fibroblastenzellen und die anschließende korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie ganzer Zellen im hydratisierten Zustand. Die Markierung enthielt fluoreszierende Quantenpunkte. Das Protokoll kann verwendet werden, um die Stöchiometrie von EGFR auf Einzelmolekülebene zu untersuchen.

Studieren der Stöchiometrie der Epidermal Growth Factor Receptor in intakten Zellen mit korrelative Mikroskopie

Wir beschreiben eine einfache zellbasierten Bioassay zum Nachweis, zur Quantifizierung und Überwachung der Aktivität der Mitglieder der vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Familie von Liganden. Der Assay verwendet chimären Rezeptoren in einem Faktor-abhängigen Zelllinie exprimiert eine semi-quantitative oder quantitative Bewertung der Rezeptorbindung bereitzustellen, und die Vernetzung durch den Liganden.

Eine einfache Bioassay für die Beurteilung von Vascular Endothelial Growth Factors

Kapillare isoelektrischen Fokussierung ist eine Antikörper-basierten, empfindsamen, hoher Durchsatz-Technik, ermöglicht detaillierte Charakterisierung von Proteinen und deren Isoformen von extrem kleinen biologischen Proben. Im folgenden beschreibt ein Protokoll für die Erkennung und Quantifizierung von spezifischen Proteinen und deren Isoformen robotisierte und automatisierte.

Hochsensible und quantitativen Nachweis von Proteinen und deren Isoformen durch Kapillare isoelektrischen Fokussierung Methode

Antikörper, die Ziel-Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden können Konformation und clustering Veränderungen verleihen. Diese dynamischen Veränderungen haben Auswirkungen für die Charakterisierung von Arzneimittelentwicklung in Zielzellen. Dieses Protokoll nutzt konfokalen Mikroskopie und Bild Korrelation Spektroskopie durch ImageJ/Fidschi, das Ausmaß des Rezeptors auf der Zelloberfläche clustering zu quantifizieren.

Konfokale Mikroskopie zeigt Zelle Oberfläche Rezeptor Aggregation über Bild Korrelation Spektroskopie

Hier präsentieren wir eine zellbasierte Flow-zytometrie-Methode zur Erkennung neutralisierende Antikörper oder andere Faktoren, die die zelluläre Aufnahme von Enzym-Ersatz-Therapien in einer menschlichen Matrix wie zerebralen spinalen Flüssigkeit (CSF) oder Humanserum stören.

Nachweis von Antikörpern, die die zelluläre Aufnahme von Enzym-Ersatz-Therapien mit einem zellbasierte Assays neutralisieren

Wir beschreiben ein quantitatives Echtzeit-In-vitro-Zytolyse-Assay-System zur Bewertung der Wirksamkeit von chimeric antigenen Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf flüssige und solide Tumorzellen abzielen. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um andere Immuneffektorzellen sowie Kombinationsbehandlungen zu bewerten.

Ein Echtzeit-Potenz-Assay für chimerantigene Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf feste und hämatologische Krebszellen abzielen

Ein notwendiger Schritt in der Entwicklung von Antikrebs-Aptamern besteht darin, seine Bindung an das Ziel zu testen. Wir demonstrieren einen durchflusszytometrischen Assay zur Untersuchung dieser Bindung und betonen die Bedeutung der Einbeziehung eines Negativkontrollaptamers und Krebszellen, die für dieses bestimmte Protein positiv oder negativ sind.

Ein auf Durchflusszytometrie basierender Zelloberflächenproteinbindungsassay zur Beurteilung der Selektivität und Spezifität eines Antikrebs-Aptamers

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für einen Antikörper-abhängigen, zellvermittelten Zytotoxizitäts-Assay (ADCC) unter Verwendung eines ADCC-Bioassay-Kits vor. Diese Methode bietet ein wertvolles Werkzeug, um den ADCC-Mechanismus aufzuklären und das therapeutische Potenzial von Antikörpern in der Krebsimmuntherapie zu bewerten.

Bewertung der Antikörper-abhängigen, zellvermittelten Zytotoxizität in Krebszellen mit Hilfe des Antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizitäts-Reporter-Bioassays

Erfahren Sie die validierte Sandwich-ELISA-Methode zur präzisen Quantifizierung von zellgebundenem und freigesetztem HER2-Protein. Diese Technik unterstützt Diagnostik und Krebsforschung mit zuverlässigen Ergebnissen.

Validierter immunchemischer Assay zur umfassenden Bestimmung des humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors 2, der aus Zellen freigesetzt und an Zellen gebunden wird (Video) | JoVE Journal

Validierter immunchemischer Assay zur umfassenden Bestimmung des humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors 2, der aus Zellen freigesetzt und an Zellen gebunden wird

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