Validierter immunchemischer Assay zur umfassenden Bestimmung des humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors 2, der aus Zellen freigesetzt und an Zellen gebunden wird

Wir präsentieren ein validiertes Sandwich, ELISA, unter Verwendung neuartiger monoklonaler Antikörper, das eine präzise Quantifizierung der zellgebundenen und freigesetzten extrazellulären Domäne des HER2-Proteins für in vitro kultivierte Zellen und Patientenproben ermöglicht.

Das Protokoll adressiert den Bedarf an genauen und validierten Assays, um die Konzentration des zirkulierenden HER2-Proteins mit den klinischen Manifestationen der Krankheit in Diagnostik und Forschung zu korrelieren.

Der breite Arbeitsbereich des Assays, die Vielfalt der Probentypen und die Zuverlässigkeit der Ergebnisse könnten neue Möglichkeiten für eine umfassende Analyse des Rezeptorstatus in in vitro und in vivo Modellen eröffnen.

Der entwickelte ELISA wird zur Quantifizierung von HER2 verwendet, das aus Krebsgeweben in verschiedene Ausscheidungen des menschlichen Körpers wie Blut, Bauchfellflüssigkeit oder Schleim freigesetzt wird.

[Dozent] Zu Beginn lösen Sie die Zellen mit Trypsin, nachdem sie eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, und sammeln Sie sie in einem separaten konischen 15-Milliliter-Röhrchen. Nach dem Zählen der Zellen mit Hilfe eines automatischen Zellzählers und der Aussaat dreimal 10 hoch fünf Zellen pro Well in einer 12-Well-Platte mit einem Milliliter Wachstumsmedium aussäen. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre, die 5 % Kohlendioxid enthält. Sammeln Sie das Kulturmedium aus der 24-Stunden-Kultur aus einer Vertiefung jeder Zelllinie in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die gesammelten Proben bei 10.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und überführen Sie den Überstand zur Lagerung bei minus 20 Grad Celsius in ein neues Röhrchen. Waschen Sie die restlichen Zellen in jeder Vertiefung mit einem Milliliter kaltem PBS, aspirieren Sie vorsichtig und entsorgen Sie das PBS. Geben Sie dann 200 Mikroliter RIPA-Puffer, ergänzt mit 1 % Proteaseinhibitor, in jede Vertiefung und inkubieren Sie fünf Minuten lang. Kratzen Sie nun die Zellen mit einem Zellschaber ab und mischen Sie das Lysat, indem Sie es mehrmals pipettieren, um es zu homogenisieren. Sammeln Sie die lysierten Zellen in ein neues Röhrchen und saugen Sie die Probe langsam in eine Zwei-Milliliter-Spritze ab, die mit einer 21-Gauge-Nadel von 0,8 x 40 Millimetern ausgestattet ist. Nach fünf- bis zehnmaligem Aspirieren zentrifugieren Sie die gesammelten Proben 10 Minuten lang bei 10.000 g bei vier Grad Celsius und überführen den Überstand zur Lagerung bei minus 20 Grad Celsius in ein neues Röhrchen. Verdünnen Sie den Anti-HER2-Fängerantikörper auf ein Mikrogramm pro Milliliter in kodierendem Puffer. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter der Auffangantikörperlösung in jede Vertiefung einer 96-Well-ELISA-Platte. Decken Sie die Platte mit Siegelfolie ab. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius. Stellen Sie die Platte nach der Inkubation über Nacht eine Stunde lang bei Raumtemperatur auf einen horizontalen Mikroplattenschüttler. Saugen Sie die Beschichtungslösung mit einem Mikrotiterplatten-Wascher an und waschen Sie jede Vertiefung dreimal mit 300 Mikrolitern PBST. Geben Sie dann mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter Blockierungspuffer mit 5 % fettfreier Trockenmilch in PBS in jede beschichtete Vertiefung, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Bereiten Sie nun die Kalibrierkurve und die Positivkontrolle vor. Fügen Sie zwei Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter, HER2-Stammlösung zu 1.998 Mikrolitern PBS hinzu, um eine Arbeitsstandardlösung von 1000 Nanogramm pro Milliliter zu erhalten. Für Standard zwei fügen Sie 500 Mikroliter Standard eins bis 500 Mikroliter PBS hinzu und mischen Sie gründlich, um eine Konzentration von 50 Nanogramm pro Milliliter zu erreichen. Bereiten Sie die serielle Verdünnung vor, um die Standards drei bis sieben zu erzeugen. Bereiten Sie anschließend Matrixproben mit PBS-Zelllysaten und Kulturmedium vor, die mit bekannten HER2-Konzentrationen versetzt sind. Verdünnen Sie die Zelllysate von eins bis 2000 mit 2,5 Mikrolitern Lysat und fünf Millilitern PBS, um HER2-Spiegel unterhalb der Nachweisgrenze zu erhalten. Um eine Lösung von zwei Nanogramm pro Milliliter herzustellen, fügen Sie acht Mikroliter Standard-Eins zu 392 Mikrolitern PBS-Kulturmedium oder Zelllysat hinzu und mischen Sie gründlich. Geben Sie mit einer Einkanalpipette 100 Mikroliter Standard-PBS-Blind- und Testproben jeweils in dreifacher Ausfertigung in ihre jeweiligen Vertiefungen der beschichteten und blockierten ELISA-Platte. Waschen Sie die Platte nach einer Stunde bei 37 Grad Celsius in einer Feuchtigkeitskammer mit einem Mikrotiterplatten-Wascher. Zum Nachweis der Antikörperbindung verdünnen Sie den biotinylierten Nachweisantikörper in PBS auf eine Arbeitskonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter. Geben Sie dann mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter dieser Nachweisantikörperlösung in jede Vertiefung. Als nächstes verdünnen Sie das AVID und das HRP-Konjugat auf 40.000 in 40 Millilitern PBST. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter des verdünnten Konjugats in jede Vertiefung. Nach dem Inkubieren und Waschen der Platte werden mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter 3,3 5,5 Tetramethylbenzidinsubstrat in jede Vertiefung gegeben, um die farbmetrische Reaktion zu starten. Decken Sie dann die Platte mit einer Siegelfolie ab. Inkubieren Sie die Platte ein bis fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius, schützen Sie sie vor Licht und überwachen Sie gleichzeitig die Farbentwicklung. Wenn die gewünschte Farbintensität erreicht ist, geben Sie 100 Mikroliter Stopplösung in jede Vertiefung, um die Reaktion zu beenden. Messen Sie abschließend die Extinktion bei 450 Nanometern mit einem Mikroplatten-Reader. Berechnen Sie anhand einer Kalibrierkurve mit vier Parametern die Probenkonzentration auf der Grundlage der Kurvengleichung. Das entwickelte Sandwich, ELISA, zeigte einen Arbeitsbereich für das HER2-Protein von 1,56 bis 100 Nanogramm pro Milliliter mit einem Bestimmungskoeffizienten von eins, was auf eine hervorragende Übereinstimmung hinweist. Die HER2-Konzentration im Kulturmedium stieg im Laufe der Zeit bei allen getesteten Zelllinien mit den höchsten Werten nach 72 Stunden an. SK-OV-3- und SK-BR-3-Zellen zeigten nach 24 Stunden im Kulturmedium etwa zehn- bzw. 50-fach höhere HER2-Konzentrationen im Vergleich zu MDA-MB-231-Zellen. In ähnlicher Weise waren die HER2-Spiegel in Lysaten für SK-OV-3 bzw. SK-BR-3 etwa drei- bzw. fünfmal höher. Interessanterweise enthielt das Zellkulturmedium 1000-fach niedrigere Konzentrationen des getesteten Antigens im Vergleich zu membrangebundenen Proteinen, die in Ganzzelllysaten vorkommen.