Isolierung von Lungen-Retinoid-haltigen Zellen durch Zellsortierung

Unsere Forschung konzentriert sich auf das Verständnis der physiologischen Rolle von Vitamin A und seinen Metaboliten, die zusammen als Retinoide bezeichnet werden, bei der Aufrechterhaltung der funktionellen Gesundheit der erwachsenen Lunge.

Aufgrund der hochspezialisierten und heterogenen zellulären Zusammensetzung der Lunge sind Einzelzelltechniken wie spezifische Zellmarkierung, -sortierung und -sequenzierung für die Untersuchung der Retinoid-vermittelten zellulären Kommunikation bei Lungengesundheit und -erkrankungen unerlässlich.

Unsere Forschung hat die bisher ungeahnte Komplexität des Retinoidstoffwechsels und der Signalübertragung in der erwachsenen Lunge und seine entscheidende Rolle beim Schutz der Lunge bei Verletzungen aufgedeckt.

Unser Protokoll ermöglicht die Isolierung spezifischer Lungenzellpopulationen auf der Grundlage der endogenen Retinoid-Autofluoreszenz und kann leicht mit Fluorochrom-konjugierten Antikörperfärbungen in alle fluoreszierenden Proteinexpressionen integriert werden.

Unsere Studien sind ein Paradigmenwechsel für das Verständnis der Mechanismen des Vitamin-A-Stoffwechsels und seiner Wirkungen. Die Ergebnisse dieser Studien können und werden sich auf aktuelle Strategien auswirken, einschließlich ernährungsphysiologischer Interventionen zur Linderung von Lungenerkrankungen.

[Moderator] Führen Sie zunächst den Zehenkneiftest an einer anästhesierten Maus durch, um den Grad der Bewusstlosigkeit zu überprüfen. Entfernen Sie lose Haare und sichtbaren Schmutz von der Operationsstelle. Wischen Sie dann den Bereich zur Desinfektion mit 70 % Alkohol sauber. Öffnen Sie mit sterilen chirurgischen Instrumenten die Bauch- und Brusthöhle. Schneide die Rippen und das Zwerchfell auf, um die Lunge und das Herz freizulegen. Schneide dann die untere Hohlvene ab. Tragen Sie ein saugfähiges Pad auf, um das freigesetzte Blut aufzusaugen. Perfundierte der Lunge in-situ durch den rechten Ventrikel des Herzens mit 5 Millilitern sterilem HBSS ohne Calcium und Magnesium. Überprüfen Sie die erfolgreiche Perfusion, indem Sie beobachten, wie sich das Lungengewebe weiß verfärbt. Perfusionieren Sie die Lunge erneut mit einer weiteren 10-Milliliter-Spritze, die mit sterilem HBSS gefüllt ist, das Enzyme, Kalzium und Magnesium enthält. Entfernen Sie nun die Lunge und geben Sie sie in eine Zellkulturschale, die 2 Milliliter steriles HBSS mit Kalzium und Magnesium enthält. Spülen Sie die Lunge unter einer laminaren Haube aus und zerkleinern Sie sie mit einer sterilen chirurgischen Klinge in kleine Stücke. Geben Sie 5 Milliliter des Enzyms HBSS, das Kalzium und Magnesium enthält, in die gehackte Lunge. Verwenden Sie dann eine serologische 10-Milliliter-Pipette, um die Suspension in ein 15-Milliliter-Röhrchen zu übertragen. Waschen Sie die Zellkulturschale mit zusätzlichen 5 Millilitern HBSS-haltigem Enzym. Füllen Sie die Waschlösung in die 15-Milliliter-Tube. Inkubieren Sie das zerkleinerte Lungengewebe in dem HBSS-haltigen Enzym auf einem rotierenden Schüttler bei 37 Grad Celsius für 45 Minuten. Pipettieren Sie das zerkleinerte Gewebe alle 15 Minuten 10 Mal durch eine serologische 10-Milliliter-Pipette in der laminaren Haube, um die Dissoziation zu verbessern. Tun Sie dies dreimal. Die resultierende Zellsuspension wird durch ein 100-Mikrometer-Sieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen geleitet, das 20 Milliliter kalte Lebendzell-Bildgebungslösung mit weniger als 5 % FBS enthält. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 g für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius. Nach dem Aspirieren des Überstands wird das Zellpellet in 1 Milliliter Lysingpuffer für rote Blutkörperchen resuspendiert und inkubiert. Wenn die Erythrozyten lysiert sind, fügen Sie der Suspension 20 Milliliter kalte Lebendzell-Bildgebungslösung hinzu, bevor Sie erneut zentrifugieren. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 20 Millilitern kalter Lebendzell-Bildgebungslösung. Die resultierende Zellsuspension wird durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen geleitet, das 20 Milliliter kalte Lebendzell-Bildgebungslösung enthält. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension wie zuvor, um die Zellen zu sammeln. Zum Schluss wird der Überstand abgesaugt und das Zellpellet in 10 Millilitern kalter Lebendzell-Bildgebungslösung resuspendiert. Zählen Sie die Zellen unter dem Mikroskop mit einem Hämozytometer und stellen Sie die Konzentration auf etwa 5 bis 10 Millionen Zellen pro Milliliter ein. Es wird ein Aliquot der vorbereiteten Zellsuspension entnommen und als ungefärbte Gating-Kontrolle beiseite gelegt. Geben Sie einen Viabilitätsfarbstoff-Zytoscreen in einer Verdünnung von 1 bis 1000 zu der verbleibenden Zellsuspension, um eine Endkonzentration von 30 Nanomolar zu erreichen. Befestigen Sie anschließend einen Filter an einem 5-Milliliter-Sammelrohr aus Polystyrol. Die Suspension durch den Filter leiten. Führen Sie eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung durch, um lebende einzelne Retinoid-haltige Zellen basierend auf ihrer Emission bei 455 Nanometern zu isolieren. Führen Sie eine sequenzielle Singulett-Unterscheidung mit einem Diagramm für Vorwärts-Streuhöhe im Vergleich zu Vorwärts-Streuflächendiagramm durch. Schließen Sie tote Zellen basierend auf Streueigenschaften und Zytoscreen-Färbung aus. Gate, sortieren und sammeln Sie einzelne lebende Retinoid-haltige Zellen basierend auf ihrer Emission bei 455 Nanometern bei Anregung bei 350 Nanometern. Führen Sie abschließend eine FACS-Datenanalyse mit einer Durchflusszytometrie-Software durch. Eine ausgeprägte Population lebender Einzelzellen mit hoher Autofluoreszenz bei 455 Nanometern wurde in den Lungenzellsuspensionen von Wildtyp-Mäusen nachgewiesen. Die gleiche autofluoreszierende Population fehlte in Lrat-Knockout-Lungenzellsuspensionen. Eine Subpopulation von tdTomato-positiven Fibroblasten wurde erfolgreich mit einem Cre-induzierbaren Markierungssystem isoliert, was eine weitere Trennung von Retinoid-haltigen Zellen von dieser Zellpopulation auf der Grundlage von Autofluoreszenz ermöglicht. Das Vorhandensein von tdTomato-positiven Lungenfibroblasten wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie bestätigt, wobei rot markierte Zellen gezeigt wurden. Das Vorhandensein von Retinoiden in sortierten Fibroblasten wurde mittels HPLC validiert, wobei Retinol und Retinolester identifiziert wurden. Lipidtröpfchen wurden in Retinoid-haltigen Fibroblasten nachgewiesen.