Name: Generierung monoklonaler Kulturen aus Wolbachia-infizierten Drosophila melanogaster JW18-Zelllinien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-27T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Lernen Sie die Generierung monoklonaler JW18-Zelllinien aus Wolbachia-infizierten Drosophila melanogaster. Diese Methode minimiert experimentelle Variabilität und ermöglicht reproduzierbare Studien zur Symbiose.

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<table><tbody><tr><td>0,22 &Mikro; m Spritzen-Fliter&nbsp; &nbsp;</td><td>Wärmekraftwerk</td><td>99722</td><td>Keimfrei</td></tr><tr><td>10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>70011044</td><td>Keimfrei</td></tr><tr><td>12 oder 18 mm rundes Deckglas&nbsp;</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon Röhrchen</td><td>Genoplast</td><td>601052</td><td>Keimfrei</td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>CytoOne</td><td>Artikel-Nr.: CC7682-7524</td><td>Behandelte Gewebekultur</td></tr><tr><td>5 & Mikro; M Spritzenvorsatzfilter</td><td>Whatman</td><td>10462000</td><td>Keimfrei</td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>CytoOne</td><td>Artikel-Nr.: CC7682-7506</td><td>Behandelte Gewebekultur</td></tr><tr><td>96-Well-Platte</td><td>CytoOne</td><td>Nr. CC7682-7596</td><td>Behandelte Gewebekultur</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Nr. J66501.30</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturflasche, 25 cm2</td><td>Greiner Bio-one</td><td>391-3103</td><td>Keimfrei</td></tr><tr><td>Zellen-Abstreifer&nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>391-3010</td><td>Keimfrei</td></tr><tr><td>Klarer Nagellack&nbsp;</td><td>Jede Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoPure Fläschchen</td><td>Sarstedt</td><td>72.379</td><td>Keimfrei</td></tr><tr><td>DMSO, Zellkulturqualität</td><td>Merck</td><td>D2650-100ML</td><td>Keimfrei</td></tr><tr><td>DreamTaq PCR-Mastermix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Nr. K1081</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>Artikel-Nr.: 324503-100GM</td><td>Keimfrei</td></tr><tr><td>Elektrophorese-Stromversorgung</td><td>Merck</td><td>PS 251-2</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Konzentrator Plus</td><td>Merck</td><td>EP5305000509</td><td>Stattdessen kann ein Vakuumkonzentrator jeder Marke verwendet werden.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1009861000</td><td></td></tr><tr><td>EVOS M5000 Bildgebungssystem</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMF5000</td><td>Inverse Mikroskope jeder Marke können zur Überwachung des Klonfortschreitens verwendet werden. Für die Visualisierung von FISH ist ein Fluoreszenzmikroskop erforderlich.</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Merck</td><td>Nr. F9665</td><td>Hitzeinaktiviert</td></tr><tr><td>Formaldehyd&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>047377.9L</td><td></td></tr><tr><td>Formamid&nbsp;</td><td>Merck</td><td>Nr. F7503-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Gelelektrophorese-Tanks</td><td>Hackbeil Wissenschaftlich</td><td>MSMIDI</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Imager</td><td>BioRad</td><td>12009077</td><td>GelDoc Go Gel-Bildgebungssystem</td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp DNA-Leiter</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Nr. SM0243</td><td></td></tr><tr><td>Heizblock</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88870005</td><td></td></tr><tr><td>Herasafe 2025 Biologische Sicherheitswerkbank Klasse II</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51033314</td><td>Biologische Sicherheitswerkbänke jeder Marke können verwendet werden, solange sie eine sterile Umgebung im Inneren aufrechterhalten.</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Lösung (20 mM) 5 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62249</td><td>Im Dunkeln lagern.</td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Merck</td><td>258148-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Integra Biosciences Corp&nbsp; PIPETBOY acu 2 Pipettierhilfe</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0085686</td><td>Serologische Pipettensteuerungen jeder Marke können verwendet werden.</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>I9516-1L</td><td></td></tr><tr><td>Gefrierschrank für Labors</td><td>&nbsp; Liebherr&nbsp;</td><td>LGUex 1500 MediLine</td><td>Jeder Gefrierschrank, der in der Lage ist, eine konstante Temperatur aufrechtzuerhalten, ist geeignet.</td></tr><tr><td>Behälter für flüssigen Stickstoff</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>CY50985</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Merck</td><td>CLS294875X25-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Wasser in molekularer Qualität</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mehrkanal-Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>3125000036</td><td></td></tr><tr><td>Nanotropfen</td><td>Peqlab</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Hämozytometer</td><td>Merck</td><td>BR717810-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm&nbsp; M Siegelfolie</td><td>Merck</td><td>HS234526B-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Peltier-gekühlter Inkubator</td><td>Memmert</td><td>IPP55plus</td><td>Gibt es einen Inkubator, der in der Lage ist, konstant 25 zu halten? C geeignet ist. Für die JW18-Zelllinie oder ihre Klone ist keine CO2-Kontrolle erforderlich.</td></tr><tr><td>Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>327115000</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten-Set</td><td>Eppendorf</td><td>EP2231300008</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumacetat</td><td>Merck</td><td>P1190-500G</td><td>Keimfrei</td></tr><tr><td>Quasar&nbsp; 670-markierte 16s rRNA FISH-Sonde&nbsp; Garnitur</td><td>Biosearch-Technologien</td><td></td><td>Sonderanfertigungen, Sequenzen der Sonden finden Sie in Tabelle 1.</td></tr><tr><td>Gekühlte Mikrozentrifuge</td><td>Labnet</td><td>C2500-R</td><td></td></tr><tr><td>RPL32 Primer Forward 5'-CCGCTTCAAGGGACAGTATC-3'</td><td>Eurofins Genomik</td><td></td><td>Sonderanfertigungen auf der Grundlage der in der Arbeit zitierten Referenz</td></tr><tr><td>rpl32 Grundierung rückwärts 5'-CAATCTCCTTGCGCTTCTTG-3'</td><td>Eurofins Genomik</td><td></td><td>Sonderanfertigungen auf der Grundlage der in der Arbeit zitierten Referenz</td></tr><tr><td>SDS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9823</td><td>Keimfrei</td></tr><tr><td>Serologische Pipetten</td><td>Corning</td><td>357771</td><td></td></tr><tr><td>Schilde und Sang M3 Insect Medium</td><td>Merck</td><td>Nr. S8398</td><td>Keimfrei</td></tr><tr><td>Stellaris RNA FISH-Hybridisierungspuffer&nbsp; &nbsp;</td><td>Biosearch-Technologien</td><td>SMF-HB1-10</td><td>Keimfrei</td></tr><tr><td>Stellaris RNA FISH Waschpuffer A&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Biosearch-Technologien</td><td>SMF-WA1-60</td><td>Keimfrei</td></tr><tr><td>Stellaris RNA FISH Waschpuffer B&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Biosearch-Technologien</td><td>SMF-WB1-20</td><td>Keimfrei</td></tr><tr><td>Sterile Reagenz-Reservoire&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8094</td><td>Keimfrei</td></tr><tr><td>TAE-Puffer</td><td>Merck</td><td>1061741000</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>TE-Puffer&nbsp;</td><td>Merck</td><td>93283</td><td>Keimfrei</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Syngen Biotech</td><td>Thermoblock 96</td><td>Stattdessen können Thermocycler jeder Marke verwendet werden.</td></tr><tr><td>Tris-Basis</td><td>Merck</td><td>10708976001</td><td>Keimfrei</td></tr><tr><td>Ultratiefkühlschrank</td><td>PHC Unternehmen&nbsp;</td><td>MDF-DU502VH-PE</td><td>Gibt es einen Laborgefrierschrank, der in der Lage ist, -80 ? C verwendet werden.</td></tr><tr><td>Vectashield Eindeckmedium&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Vector Laboratorien</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>WSP Primer Forward 5'-TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC-3'</td><td>Eurofins Genomik</td><td></td><td>Sonderanfertigungen auf der Grundlage der in der Arbeit zitierten Referenz</td></tr><tr><td>WSP Primer Reverse 5'-AAAAATTAAACGCTACTCCA-3'</td><td>Eurofins Genomik</td><td></td><td>Sonderanfertigungen auf der Grundlage der in der Arbeit zitierten Referenz</td></tr></tbody></table>

generierung monoklonaler kulturen aus wolbachia-infizierten drosophila melanogaster jw18-zelllinien

Generation of Monoclonal Cultures from Wolbachia-infected Drosophila melanogaster JW18 Cell Line

Wir visualisierten den Prozess der Etablierung monoklonaler Kulturen mit Lichtmikroskopie vom Tag der Vorbereitung der Einzelzellsuspension und -plattierung (Tag 0) bis zur Etablierung kontinuierlicher Zelllinien (Tag 45 oder 77, Abbildung 2). Die ersten Anzeichen einer Zellteilung wurden an Tag 3 (4 Tage nach der Beschichtung, da die Beschichtung an Tag 0 durchgeführt wurde) beobachtet, als bereits vier Zellen pro Vertiefung vorhanden waren (Abbildung 2). An Tag 14 wuchsen die Klone entweder als Monoschicht (JW18-B9, C7 und E5) oder als Kugel (JW18-G4), die während der Passage zerstört wurde. Am Tag 28 waren die Unterschiede im Wachstum zwischen den Zelllinien am deutlichsten. Die JW18-C7-Kultur war an Tag 45 konfluent, während die restlichen klonalen Kulturen erst an Tag 77 etabliert wurden. Wir haben auch die vier verschiedenen Kulturen 30 Passagen nach der Etablierung visualisiert, um Unterschiede in der Zellmorphologie zu erfassen (Abbildung 3).
Um den Wolbachia-Infektionsstatus der monoklonalen Kulturen zu bestimmen, führten wir PCR (Abbildung 4) und FISH (Abbildung 5) durch. Wir beobachteten, dass alle bis auf einen Klon (JW18-C7) eine Bande für das wsp-Gen produzierten, was auf eine Wolbachia-Infektion hindeutet. FISH bestätigte die PCR-Ergebnisse: Die Klone JW18-B9, JW18-E5 und JW18-G4 behielten die Wolbachia-Infektion bei, während der Klon JW18-C7 keine Wolbachia aufwies. Insgesamt konnten wir aus einer gemischten JW18-Zellpopulation vier klonale Kulturen etablieren, von denen drei die ursprüngliche Wolbachia-Infektion beibehielten. Die Rohdaten können unter Figshare abgerufen werden: https://figshare.com/s/15fde47ca7338f31dda9.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Arbeitsablauf für die Generierung monoklonaler Kulturen. (A) Primäre und sekundäre Verdünnungen in der 96-Well-Platte. (B) Einzelzellen nach serieller Verdünnung. (C-E) Fortschreiten der Vermehrung von Zellen und Transfer von einer 96-Well- auf eine 24- bzw. 6-Well-Platte. (F) Kontinuierliche Kulturen in 25cm 2-Zell-Kulturflaschen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Progression der klonalen JW18-Linien von einer Einzelzell- zu einer mehrzelligen Kultur. Hellfeldbilder von klonalen Linien vom Tag 0 (Tag der Platingierung) bis zum Tag 77, an dem alle Linien erfolgreich in einem 25 cm 2-Zell-Kulturkolben etabliert wurden. Maßstabsbalken = 25 μm (Tag 0), 50 μm (Tag 3), 150 μm (Tag 14), 300 μm (Tag 28, 45, 77). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Morphologie einzelner klonaler Linien von JW18. Hellfeldbilder von klonalen Linien, die die Zellmorphologien bei Passage 30 nach der Etablierung zeigen. Maßstabsleisten = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig4.jpg"> 
Abbildung 4: Wolbachia-Status von klonalen Kulturen, die mittels PCR untersucht wurden. PCR für Wolbachia in der elterlichen Zelllinie JW18 und den klonalen Linien JW18-B9, JW18-C7, JW18-E5 und JW18-G4 in Passage 11 nach der Etablierung. Die Wolbachiawsp-Bande bestätigt das Vorhandensein von Wolbachia, während die Drosophilarpl32-Bande eine DNA-Qualitätskontroll-PCR ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig5.jpg"> 
Abbildung 5: Wolbachia-Status von klonalen Kulturen, die mit FISH untersucht wurden. JW18 elterliche Zelllinie und Klone JW18-B9, JW18-C7, JW18-E5, JW18-G4 sichtbar durch FISH-Färbung in Passage 13 nach der Etablierung. Wolbachia wird mit dem Quasar 670-markierten 16s rRNA Stellaris FISH-Sondenset in Magenta gefärbt, und Nukleinsäuren werden mit Hoechst 33342 in Cyan gefärbt. Maßstabsbalken = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Tabelle S1: Oligonukleotidsonden gegen Wolbachia wMel 16S rDNA und ihr Vergleich mit den von Schneider et al. veröffentlichten Sonden42. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/Table%20S1.%20Stellaris%20probe%20set%20_16052025.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Generierung monoklonaler Kulturen aus Wolbachia-infizierten Drosophila melanogaster JW18-Zelllinien

Cell lines are widely used models in biological research. They are particularly useful in studies of intracellular bacteria that cannot be efficiently ...

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