Arbeitsablauf mit einem kryogenen Koinzidenz-Fluoreszenz-, Elektronen- und Ionenstrahlmikroskop zur gezielten Fräsung von Zellen
17. Oktober 2025
Dieser Workflow ermöglicht die Lamellenproduktion für fluoreszenzmarkierte biologische Strukturen, die klein (<1 μm axiale Ausdehnung) und selten (1 Kopie pro Zelle) sind, unter Verwendung einer kryogenen trikoinzidenten Bildgebungsplattform. Diese Plattform integriert Fluoreszenzmikroskopie, fokussiertes Ionenstrahlfräsen und Rasterelektronenmikroskopie in einer einzigen Fokusposition und ermöglicht die gleichzeitige Fluoreszenzmikroskopie während des Fräsens.
Meine Forschung entwickelt optische Mikroskopiemethoden zur Erhaltung zellulärer Merkmale in kryogenen Lamellen während des fokussierten Ionenstrahl-Fräsens, was eine detaillierte Analyse durch kryogene Elektronentomographie ermöglicht, um die native biologische Organisation zu entdecken. Optische Mikroskopie wurde in CryoFIB-SEM-Systeme integriert, jedoch selten an derselben Position wie das FIB. Dies erfordert registrierungsbasierte Leitlinien, um fluoreszierend markierte Ziele in der Endlamelle zu erhalten.
Zunächst kühlen Sie die Transferstation manuell mit flüssigem Stickstoff, sobald die Stufe kryogene Temperaturen erreicht hat. Laden Sie ein geclipptes Autogrid in die Sample-Kassette, die für das kryogene Lichtmikroskopiesystem entwickelt wurde. Stellen Sie sicher, dass das Autogrid zwischen dem verklebten Deckelverschluss und dem Abstandshalter positioniert ist.
Ziehe die Ringschnecke fest, um die Kassette zu schließen, und stecke sie in den Schlitz der Transferstation. Verbinden Sie die Transferstation mit dem kryogenen Lichtmikroskopiesystem. Verwenden Sie die interne Kammerkamera, um die Sample-Kassette auf die Sample-Stage zu führen.
In der Lichtmikroskopie-Software wird die Probestufe von der Ladeposition auf die vordefinierte Dreistrahl-Position bewegt. In der FIB-SEM-Software stellen Sie die Vergrößerung auf 100X ein und klicken Sie auf das Fenster oben links. Im Ausrichtungstab der Lichtmikroskopie-Software klicken Sie auf Z und wählen Sie die Play-Funktion aus, um einen SEM-Atlas des Gitters zu erhalten.
Identifizieren Sie eine quadratische Fläche mit gebrochener Kohlefolie und klicken Sie doppelt darauf, um die Probenstufe an diesen Ort zu bewegen. Kehren Sie zur Softwareoberfläche zurück. Aktivieren Sie den FIB und nehmen Sie ein Bild auf.
Passen Sie die Vergrößerung über das Dropdown-Menü oben links an. Drücken Sie Play, um das FIB-Bild anzuzeigen. Dann stell die Schrittweite mit der Schiebeleiste ein.
Klicken Sie nun auf Z und Z, um die Position der Stufe Z anzupassen, bis die horizontale Linie im Ion und die Elektronenbilder mit demselben Merkmal übereinstimmen. Wähle den SEM-Tab in der Lichtmikroskopie-Software. Verwenden Sie die X- und Y-Tasten, um ein gemeinsames Merkmal zwischen SEM- und Ionenbildern auszurichten.
Jetzt schalte das Fluoreszenzmikroskop ein. Wählen Sie den Tab FLM, stellen Sie die Bildgebungsbedingungen für reflektiertes Licht ein und wählen Sie Play. Dann richten Sie das reflektierte Lichtbild mit dem SEM-Bild aus.
Zoome auf das Bild und klicke auf die Rechteck-Option, um ein Fräsmuster für den Ionenstrahl zu definieren. Drücke Start Patterning in Display 2, um ein kleines Muster mit dem fokussierten Ionenstrahl zu fräsen. Bestätigen Sie, dass das gefräste Muster sowohl im fokussierten Ionenstrahl als auch im fluoreszierenden Mikroskop sichtbar ist.
In der Lichtmikroskopie-Software gehen Sie zum Reiter Lokalisierung und aktivieren Sie die entsprechenden Bedingungen, um die Fluoreszierkanäle einzurichten. Weisen Sie jedem Fluorophor einem separaten Kanal zu und fügen Sie einen zusätzlichen Kanal für Brightfield hinzu. Passen Sie die LED-Leistung und Belichtungszeit für jeden Leuchtstoffröhrenkanal an, um das gewünschte Ziel zu identifizieren.
Sobald die Parameter zufriedenstellend sind, erhält man einen vorfräsenden fluoreszierenden Z-Stack, indem man durch die axiale Richtung geht. Markiere dann das Ziel als Interessensbereich. Wechsle zur FIB-SEM-Software und zeichne eine Lamelle im Interessensbereich.
Führen Sie Rohfräsen durch, um das Bulkmaterial zu entfernen, während das Fluoreszenzmikroskop eingeschaltet bleibt, um Signaländerungen zu überwachen. Öffnen Sie das auf Python basierende interferometrische Toolkit am Terminal, um das fluoreszierende Signal während der Lamellenverdünnung zu überwachen. Reduzieren Sie den ROI mit dem Reinigungsquerschnittsmodus auf etwa zwei Mikrometer.
Für ein Ziel mit einer axialen Ausdehnung von über 300 Nanometern wählen Sie in der Python-GUI das Ziel im Fluoreszenzmikroskop aus. Die Software beginnt automatisch, die Helligkeit als Funktion der Zeit mit jedem neuen Bild zu plotten. Überwachen Sie die Fluoreszenzintensität mit dem Python-Toolkit.
Fräsen Sie die Probe mit Reinigungsquerschnittsmodus, um eventuelle verbleibende Trägerfolien unterhalb des interessierenden Bereichs zu entfernen. Beobachten Sie plötzliche Abfälle der Fluoreszenzintensität als Hinweise zum Wechsel der Fräsrichtung. Wenn beim Fräsen von unten nach oben eine starke Abnahme beobachtet wird, stoppen Sie und beginnen Sie mit dem Fräsen von oben nach unten.
Nach Abschluss des Top-Down-Fräsens wird die Lamelle durch Fräsen von unten nach oben im Reinigungsquerschnittsmodus finalisiert, bis die gewünschte Dicke erreicht ist. Dann nehmen Sie ein Nachfräsen-Fluoreszenzbild der Lamelle auf. Übertragen Sie die Probe in ein CryoTEM.
Laden Sie das Nachbearbeitungs-Mehrkanal-Fluoreszenzbild und das CryoTEM-Projektionsbild in die maßgeschneiderte projektive Transformationssoftware zur Registrierung des Interessenbereichs. Wählen Sie nun acht bis zehn Paare von Referenzpunkten aus, die sowohl in Fluoreszenz- als auch in Elektronenmikroskopiebildern sichtbar sind, um die projektive Transformation zu berechnen. Verwenden Sie das überlagerte Bild als Leitfaden, um einen Bildgebungsbereich auszuwählen.
Wählen Sie dann entsprechend der Größe der Zielstruktur und der gewünschten Auflösung geeignete Vergrößerungs- und Aufnahmeparameter für die Neigungsserie aus. Differenzierte Makrophagenzellen, die mit SiR-Tubulin markiert waren, zeigten einen einzelnen hellen fluoreszierenden Punctum, etwa einen Mikrometer im Durchmesser, entsprechend dem MTOC, sowie fibroähnliche Strukturen, die zur Zellperipherie abstrahlten, die mit dem Mikrotubulinetzwerk übereinstimmten. Während die Probe auf etwa 800 Nanometer Dicke gemahlen wurde, löste sich der einzelne fluoreszierende MTOC-Punctum in zwei unterschiedliche Speckles auf, jeweils etwa 700 Nanometer im Durchmesser.
Die Fluoreszenzintensität nahm nach Entfernung des nicht-fluoreszierenden Bulkmaterials und des absorbierenden Trägerfilms zu, gefolgt von einer starken Abnahme, als die Lamelle von zwei Mikrometern auf unter 200 Nanometer weiter verdünnt wurde. Korrelierte kryogene Fluoreszenz und Elektronenmikroskopie ermöglichten präzise Zielsetzung von Strukturen während des Fräsens. Rekonstruierte Tomogramme und segmentierte Modelle zeigen, dass die Zentriolen aus Mikrotubuli-Tripeln bestehen.
In Fällen, in denen nur ein fluoreszierender Fleck in der finalen Lamelle erhalten blieb, wurde ein einzelner Centriol im entsprechenden Tomogramm sichtbar. Die Genauigkeit der Fluoreszenz basierend auf Millimilling ist durch Registrierungsmethoden begrenzt, die stark unter beugungsbegrenzter Auflösung, Brechungsindex-Fehlanpassungen und auch durch Fräsen induzierten Bewegungen leiden. Gleichzeitige optische Mikroskopie und FIB-Fräsen beseitigen Registrierungsfehler, indem stattdessen Echtzeit-Rückkopplungen aus der Fluoreszenzmikroskopie zur Steuerung des Fräsprozesses verwendet werden.
Dies vermeidet Fehler aufgrund der Beugungsgrenze und des Brechungsindex-Fehlangleichs, was präzises Fräsen ermöglicht, das fluoreszenzmarkierte Strukturen für die Kryoelektronentomographie innerhalb der finalen Lamelle bewahrt. Unsere Forschung ermöglicht es, zelluläre Strukturen zu erkennen, die zuvor schwer direkt visualisierbar waren durch KryoET, und beleuchten so molekulare Mechanismen hinter einem breiten Spektrum wichtiger mikromolekularer Maschinen.
Überblick
Dieser Workflow ermöglicht die Herstellung von kryogenen Lamellen, die auf fluoreszenzmarkierte biologische Strukturen abzielen, die klein und selten sind. Die Integration von Fluoreszenzmikroskopie, fokussierter Ionenstrahl-Schleifbearbeitung und Rasterelektronenmikroskopie an einer einzelnen Fokusposition ermöglicht simultanes Bilden und Schleifen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsgebiet
- Neurowissenschaften
- Biophysik
- Mikroskopie-Techniken
Hintergrund
- Optische Mikroskopie-Methoden sind essentiell für die Erhaltung zellulärer Merkmale während des Schleifens.
- Die Integration der Fluoreszenzmikroskopie in CryoFIB-SEM-Systeme ist selten.
- Registrierungsbasierte Führung ist notwendig, um fluoreszenzmarkierte Ziele zu erhalten.
- Das Verständnis der nativen biologischen Organisation ist entscheidend für die detaillierte Analyse.
Zweck der Studie
- Methoden zur Erhaltung zellulärer Merkmale in kryogenen Lamellen zu entwickeln.
- Detaillierte Analyse durch kryogene Elektronentomographie zu ermöglichen.
- Die Genauigkeit des Targetings fluoreszierender Strukturen während des Schleifens zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Manuelle Kühlung der Transferstation mit flüssigem Stickstoff.
- Integration der Fluoreszenzmikroskopie mit FIB-SEM-Systemen.
- Erfassung von fluoreszierenden z-Stacks vor dem Schleifen.
- Überwachung der Fluoreszenzintensität während des Schleifens mittels Python-Toolkit.
Hauptergebnisse
- Die Fluoreszenzintensität nahm nach Entfernen nicht-fluoreszierenden Bulk-Materials zu.
- Korrelierte kryogene Fluoreszenz- und Elektronenmikroskopie ermöglichten präzises Targeting.
- Rekonstruierte Tomogramm-Bilder zeigten die Struktur von Zentriolen.
- Einzelne Zentriolen-Visualisierung wurde in einigen Fällen erreicht.
Schlussfolgerungen
- Die Studie demonstriert effektive Methoden für die Herstellung kryogener Lamellen.
- Fluoreszenzbasiertes Targeting verbessert die Genauigkeit der strukturellen Analyse.
- Die Integration von Bildgebungstechniken verbessert das Verständnis biologischer Organisation.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Simultaneous cryogenic fluorescence, electron, and ion beam microscopy enables precise, real-time targeting of rare cellular structures during lamella preparation for cryo-electron tomography. This workflow eliminates registration errors and enhances the preservation of disease-relevant subcellular features, directly impacting early discovery and mechanistic de-risking. The approach supports higher predictive confidence in structural biology pipelines and facilitates risk-adjusted portfolio decisions for complex biological targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization and preservation of fluorescently labeled subcellular targets during sample preparation.
- Reduces ambiguity in mechanistic studies by maintaining structural integrity of rare or small features.
- Improves predictive confidence for target validation by correlating fluorescence with ultrastructural data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated lamellae for downstream high-resolution imaging and quantitative analysis.
- Supports reproducible sample preparation by integrating real-time fluorescence feedback during milling.
- Facilitates standardization of workflows for screening rare cellular events or phenotypes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural preservation with translational biomarker discovery when fluorescent labels mark disease-relevant features.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting correlative imaging strategies.
- De-risks advancement decisions by providing high-fidelity structural data on targets of interest.
Pipeline & Workflow Integration
This tri-coincident imaging workflow integrates at the interface of discovery biology and structural analysis, bridging early target validation with preclinical model characterization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct observation of labeled structures during milling.
- Screening: Provides reproducible, quantitative lamella preparation for downstream imaging assays.
- Analytics: Delivers real-time fluorescence intensity measurements to guide and document sample processing.
- Translational Research: Maintains alignment between molecular labeling and ultrastructural readouts for biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized workflow for targeting diverse cellular structures across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural biology.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of lamella preparation for high-resolution imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust structural data on rare targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on direct structural evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryogenic microscopy, fluorescence imaging, and focused ion beam operation.
- Demands integrated instrumentation capable of simultaneous tri-modal imaging and milling.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and sample handling protocols.
- Adaptation may be needed for different cell types or labeling strategies.
- Practical limitations include fluorescence signal stability and potential milling-induced motion artifacts.
