Mausmodell der metabolischen Dysfunktion-assoziierten steatotischen Lebererkrankung mit Fibrose

In unserer Forschung konzentrieren wir uns auf die mit metabolischer Dysfunktion assoziierte steatotische Lebererkrankung (MASLD) und speziell auf die Mechanismen der Lipidansammlung und Fibrose. Einige der jüngsten Entwicklungen sind Einzelzell- und spezielle Transkriptomik, die Standardisierung von Tiermodellen von MASLD sowie die Zulassung von Semaglutid zur Behandlung von MASLD. Es gibt viele Tiermodelle von MASLD, aber wir haben herausgefunden, dass viele keine Leberfibrose induzieren.

Um diesen Punkt zu adressieren, haben wir unser Mausmodell von MASLD entwickelt. Unser Mausmodell induziert MASLD mit Fibrose, indem es hyperphagischen Mäusen eine Ernährung gibt, die der durchschnittlichen amerikanischen Ernährung ähnelt. Dies verursacht MASLD, das der Krankheit beim Menschen sehr ähnlich ist.

Unsere Methode wird Studien zur Pathophysiologie von MASLD und die Erprobung neuer Therapien erleichtern. Zu Beginn nehmen Sie einen mit Paraffin eingebetteten Lebergewebeschnitt auf einem Objektträger. Zur Entparaffinisierung tauchen Sie den Objektträger für fünf bis fünfzehn Minuten in Xylol oder Citrisolv ein.

Anschließend rehydrieren Sie den Abschnitt serienmäßig in 100, 95 und 70 % Ethanol, gefolgt von destilliertem Wasser für jeweils fünf Minuten. Dann beben Sie den Abschnitt mit Sirius Red und trocknen Sie den Objektträger aus. Nimm jeweils einen Slide aus der Reinigungslösung und tupfe ihn auf Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.

Füge etwa 50 bis 100 Mikroliter Montagemedium zum Abschnitt hinzu. Decken Sie den Abschnitt mit einem Deckel ab und drücken Sie ihn vorsichtig nach unten, um Luftblasen zu entfernen. Lass den Rutsch an der Luft trocknen.

Betrachten Sie nun den vorbereiteten Abschnitt unter einem Lichtmikroskop mit Hellfeldbeleuchtung und 4- bis 20-fachen Objektiven. Übertragen Sie etwa 500 bis 1000 Mikroliter Leberhomogenat in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhren und fügen Sie Trichloressigsäure hinzu, um eine Endkonzentration von 12 % zu erreichen, um das Rohr kurzzeitig vorzuhalten, um den Inhalt zu mischen. Inkubieren Sie das Rohr 30 Minuten in einem Eiswasserbad und zentrifugieren Sie es bei 6.000 g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.

Dann entfernen Sie das Überdachte mit einer Pipette. Gib einen Milliliter 100 % eiskaltes Ethanol dazu, um das Pellet zu waschen, und sonikiere es gründlich, damit es wieder aufhält. Nach dem erneuten Zentrifugieren der Suspension aspirieren Sie das Übersetzungsmittel.

Nach dem dritten Waschen lassen Sie das Rohr offen, um das Pellet nach Bedarf 10 Minuten oder länger an der Luft zu trocknen. Dann geben Sie 800 Mikroliter 6 normale Salzsäure in das Rohr mit dem Proteinpellet und suspendieren Sie das Pellet mit einem Sonikator, wie zuvor gezeigt. Übertragen Sie die Suspension auf ein mit Schrauben versehenes Glasröhrchen oder -fläschchen und schließen Sie den Deckel fest ab.

Inkubieren Sie das Rohr etwa 22 Stunden lang bei 110 Grad Celsius im Ofen. Bei Bedarf werden die Inhalte aus dem Glasfläschchen vor dem Schleudern in ein Zentrifugenrohr umgeleitet. Zentrifugiere die hydrolysierte Probe bei 16.000 g für 10 Minuten und aspiriere das Supernatant mit Hydroxyprolin in ein 1,5-Milliliter-Rohr.

Für die Hydroxyprolinoxidation geben Sie 450 Mikroliter Chloraminlösung in Röhren mit 50 Mikrolitern Probe und Standards. Mische den Inhalt in den Röhren mit einem Wirbel und brüte sie 25 Minuten lang bei Zimmertemperatur. Dann fügen Sie 500 Mikroliter Ehrlichs Reagenz zu jeder Probe und jedem Standard hinzu.

Nach dem Vortex inkubieren Sie die Proben bei 65 Grad Celsius für 20 Minuten in einem Inkubator. Nach der Brütung lassen Sie die Röhrchen auf Raumtemperatur abkühlen und betrachten Sie die endgültige Farbe der Proben. Schließlich wird die Absorption von Proben und Standards mit einem Spektrophotometer bei einer Wellenlänge von 550 Nanometern gemessen.

Die Kollagenfärbung des Lebergewebes mit Picro Sirius Red zeigte bei hellem Feldlicht Kollagenrot mit einem hellorangen oder gelben Hintergrund. Die Kollagenablagerung, die der Fibrose entspricht, wurde ebenso gefärbt wie Kollagen in den Blutgefäßwänden, im Hilum und in der Leberkapsel. Die polarisierte Lichtmikroskopie zeigte deutlich doppelbrechende Kollagenfasern auf dunklem Hintergrund, was die Visualisierung der Fibrose verbessert.

Die Quantifizierung des Leber-Kollagen-positiven Bereichs bei Agouti-Gelbemäusen, die mit einer fettreichen und fructosereichen Diät, (HFFD) gefüttert wurden, zeigte im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollmäusen, die mit fettarmer und fruktosearmer Ernährung gefüttert wurden, signifikant höhere Fibrose. Die Quantifizierung des Leberhydroxyprolingehalts zeigte einen signifikant höheren Wert bei Agouti-Gelbmäusen, die mit HFFD-Diät gefüttert wurden, im Vergleich zu den Kontrollmäusen nach 16 Wochen auf der Diät, was eine erhöhte Kollagenablagerung in fibrotischen Lebern bestätigt.