Name: Isolierung und durchflusszytometrische Bewertung neuroimmuner Interaktionen in einem Mini-Schlaganfall-Mausmodell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und durchflusszytometrische Bewertung neuroimmuner Interaktionen in einem Mini-Schlaganfall-Mausmodell. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Analyse immunologischer Reaktionen nach ischämischem Schlaganfall.

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<li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+controls%2C+instrument+setup%2C+and+the+determination+of+positivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry. 69A, 1037-1042 (2006).</li>
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<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia-associated+neuroinflammation+is+a+potential+therapeutic+target+for+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Microglia-associated neuroinflammation is a potential therapeutic target for ischemic stroke.</a> Neural Regen Res. 16 (1), 6-11 (2021).</li>
<li>Mao, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+polarization+in+ischemic+stroke%3A+Complex+mechanisms+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+Med+J+%28Engl%29%22%5BJournal%5D)">Microglia polarization in ischemic stroke: Complex mechanisms and therapeutic interventions.</a> Chin Med J (Engl). 134 (20), 2415-2417 (2021).</li>
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<li>Leelatian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+human+tissues+and+solid+tumors+with+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+B+Clin+Cytom%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry.</a> Cytometry B Clin Cytom. 92 (1), 68-78 (2017).</li>
<li>Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+Surface+markers+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: Surface markers and beyond.</a> J Allergy Clin Immunol. 143 (2), 528-537 (2019).</li>
<li>Schmit, T., Klomp, M., Khan, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+flow+cytometry+for+simultaneous+and+multi-parametric+analysis+of+heterogenous+cell+populations+in+basic+and+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The application of flow cytometry for simultaneous and multi-parametric analysis of heterogenous cell populations in basic and clinical research.</a> Methods Mol Biol. 2223, 183-200 (2021).</li>
<li>Dukhinova, M., Kopeikina, E., Ponomarev, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usage+of+multiparameter+flow+cytometry+to+study+microglia+and+macrophage+heterogeneity+in+the+central+nervous+system+during+neuroinflammation+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Usage of multiparameter flow cytometry to study microglia and macrophage heterogeneity in the central nervous system during neuroinflammation and neurodegeneration.</a> Methods Mol Biol. 1745, 167-177 (2018).</li>
<li>Rui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+gasdermin+d+drives+early-stage+T-cell+immunity+and+peripheral+inflammation+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Myeloid gasdermin d drives early-stage T-cell immunity and peripheral inflammation in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Neuroinflammation. 21 (1), 266(2024).</li>
<li>Rauber, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+identifies+changes+in+peripheral+and+intrathecal+lymphocyte+patterns+in+CNS+autoimmune+disorders+and+primary+CNS+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry identifies changes in peripheral and intrathecal lymphocyte patterns in CNS autoimmune disorders and primary CNS malignancies.</a> J Neuroinflammation. 21 (1), 286(2024).</li>
<li>Rayaprolu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+microglial+sorting+coupled+with+quantitative+proteomics+identifies+moesin+as+a+highly-abundant+microglial+protein+with+relevance+to+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric microglial sorting coupled with quantitative proteomics identifies moesin as a highly-abundant microglial protein with relevance to Alzheimer's disease.</a> Mol Neurodegener. 15 (1), 28(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>NEST&nbsp;</td><td>615601</td><td>Material für das Labor</td></tr><tr><td>1&mal; PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>96-Well-Mikrotiterplatte mit klarem Rundboden, TC-behandelt</td><td>Corning</td><td>3799</td><td>Material für das Labor</td></tr><tr><td>APC Anti-Maus CD19</td><td>Biolegende</td><td>152410</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>APC/Cyanin7 Anti-Maus CD45</td><td>Biolegende</td><td>103116</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Avertin (1,25 %)</td><td>Nanjing Aibei Biotechnologie&nbsp;</td><td>Nr. M2920</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD</td><td>642510</td><td>Ausrüstung</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 Anti-Maus CD4</td><td>Biolegende</td><td>100437</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 Anti-Maus / Mensch CD11b</td><td>Biolegende</td><td>101237</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. A1933-1G</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>Kollagenase IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. C4-28-100MG</td><td>Enzym</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Neuengland Biolabore</td><td>M0303L</td><td>Enzym</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS-100G</td><td>Chemisch</td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Reagenzgläser aus Polystyrol mit rundem Boden</td><td>Corning</td><td>352052</td><td>Material für das Labor</td></tr><tr><td>Falke&nbsp; Konische 15-ml-Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>352095</td><td>Material für das Labor</td></tr><tr><td>FlowJo V10</td><td>BD</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>GLAST (ACSA-1) Antikörper, PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-118-344</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>RWD Biowissenschaften</td><td>Nr. R510-22-10</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>PE/Cyanin7 Anti-Maus CD3</td><td>Biolegende</td><td>100220</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>PE/Dazzle 594 Anti-Maus NK-1.1</td><td>Biolegende</td><td>156518</td><td>Antikörper</td></tr><tr><td>TRIzol Reagenz</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>15596026</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Ultrareines DNase/RNase-freies destilliertes Wasser</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>10977015</td><td>Reagenz</td></tr><tr><td>Vetbond Tissue-Klebstoffe</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>Material für das Labor</td></tr><tr><td>Zombie Aqua Reparierbares Lebensfähigkeitsset</td><td>Biolegende</td><td>423102</td><td>Amin-reaktiver Fluoreszenzfarbstoff</td></tr></tbody></table>

isolierung und durchflusszytometrische bewertung neuroimmuner interaktionen in einem mini-schlaganfall-mausmodell

Isolation and Flow Cytometric Assessment of Neuroimmune Interactions in a Mini-Stroke Murine Model

In dieser Studie stellen wir ein verfeinertes Protokoll zur Bewertung der Funktionalität von Immunzellen nach ischämischem Schlaganfall vor, das eine durchflusszytometrische Analyse innerhalb eines Mini-Schlaganfallmodells verwendet. Der Mini-Schlaganfall wurde durch die permanente Ligatur des distalen Astes der rechten mittleren Hirnarterie (MCA) induziert, gefolgt von einem 7-minütigen Verschluss der bilateralen Arteria carotis communis (CCAs). Diese Methode führt zu einem milden Schlaganfall, der sich durch kleine, ko...

Isolierung und durchflusszytometrische Bewertung neuroimmuner Interaktionen in einem Mini-Schlaganfall-Mausmodell

Stroke is a leading cause of death and long-term disability worldwide, with ischemic stroke representing the majority of cases. Following an ischemic ...

Der Schwerpunkt unserer Forschung liegt auf der Funktion von Immunzellen nach ischämischem Schlaganfall. Unser Ziel ist es, die Gesetzmäßigkeiten von residenten und infiltrierenden Immunzellen in der Schlaganfallpathologie zu verstehen. Derzeit wird die Durchflusszytometrie häufig eingesetzt, um die Funktion und Wechselwirkungen von Immunzellen bei Neuroinflammationen zu beurteilen.Darüber hinaus treiben Immuntechniken sowie Einzelzell- und Sequenzierung die Forschung im Bereich der Neuroimmuninteraktionen voran. Unser Labor wird sich auf die Veranschaulichung des Weges von Astrozyten in neuroimmunen Interaktionen und den Beitrag von Angio zu neuroinflammatorischen Prozessen konzentrieren. Nehmen Sie zunächst eine 50-Milliliter-Spritze und befestigen Sie eine 26-Gauge-Nadel an ihrem Ende.Füllen Sie die Spritze vollständig mit Kochsalzlösung. Positionieren Sie die betäubte Maus in Rückenlage auf einer Schaumstoffplatte. Strecken Sie die Vorder- und Hintergliedmaßen aus und befestigen Sie sie mit 26-Gauge-Nadeln.Fassen Sie mit einer gezackten Daumenzange die Bauchhaut und machen Sie einen seitlichen Schnitt, um die Leber freizulegen. Schneiden Sie an beiden Seiten der Rippen entlang, um das Herz freizulegen. Führen Sie nun die 26-Gauge-Nadel in den linken Ventrikel ein und trennen Sie das rechte Orakel ab.Drücken Sie den Kolben der Spritze, damit das Blut abfließen kann. Fahre mit der Perfusion fort, bis das Blut, das aus dem Orakel abfließt, klar erscheint. Nachdem Sie die Maus geköpft und das Gehirn extrahiert haben, übertragen Sie es in eine Gehirnmatrix aus Mausstahl und teilen Sie es in aufeinanderfolgende zwei Millimeter dicke Hornhautscheiben.Geben Sie 500 Mikroliter der Verdauungsenzymmischung in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte. Trennen Sie das Infarktgewebe mit einer Mikrozange vorsichtig und überführen Sie es in die Verdauungsenzymmischung. Zum Schluss fragmentieren Sie das Gewebe mit einer Augenschere in möglichst kleine Stücke und inkubieren die Platte 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Mit der AP 1000 Pipette die Lösung 10 Mal vorsichtig aspirieren und dosieren, um das Gewebe in einzelne Zellen zu dissoziieren. Anschließend wird die Lösung durch ein 70-Mikrometer-Zellensieb geleitet. Spülen Sie sowohl die 12-Well-Platte als auch das Zellsieb wiederholt mit eiskaltem HBSS, das Calcium und Magnesium enthält.Zentrifugieren Sie nun die gesammelte Zellsuspension bei 500 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören. Suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter PBS.Nach Wiederholung des Zentrifugationsvorgangs wird das Pellet erneut in 150 Mikrolitern PBS resuspendiert und die Suspension in eine runde Bodenplatte mit 96 Vertiefungen überführt. Zentrifugieren Sie erneut bei 500 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Fassen Sie nach dem Zentrifugieren die 96-Well-Platte fest an und drehen Sie sie schnell um, um den Überstand zu entsorgen.Als nächstes verdünnen Sie die Fluoreszenzmatrize der Zellviabilität in einem Verhältnis von eins zu hundert in PBS und resuspendieren Sie das Pellet in 150 Mikrolitern der verdünnten Farbstofflösung. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und dabei die Platte vor Licht schützen. Nach fünfminütigem Zentrifugieren bei vier Grad Celsius wird der Überstand verworfen.Verdünnen Sie den Antikörper-Cocktail auf der Zelloberfläche in magnetisch aktivierter Zellsortierung oder Max-Puffer und geben Sie den Antikörper-Cocktail in die Vertiefungen, ohne die Zellen zu waschen. Inkubieren Sie 15 bis 20 Minuten bei vier Grad Celsius, bevor Sie weitere fünf Minuten zentrifugieren. Nachdem Sie die Platte zentrifugiert und den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie das Pellet in maximal 150 Mikrolitern Puffer.Die Suspension wird in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen oder fünf Milliliter Polystyrol-Reagenzgläser mit rundem Boden überführt. Entwerfen Sie ein mehrfarbiges Durchflusszytometrie-Panel entsprechend der Gerätekonfiguration, entweder mit manuellen Methoden oder mit einem Online-Panel-Design-Tool. Fügen Sie einen Zellviabilitätsfarbstoff in das Panel ein, um nicht lebensfähige Zellen und Ablagerungen aus den Daten auszuschließen.Passen Sie die Einstellungen für den Vorwärtsstreu- und den Seitenstreudetektor an, um sicherzustellen, dass die interessierenden Zellen korrekt angezeigt werden und ordnungsgemäß gesteuert werden können. Feinabstimmung der FSC- und SSC-Parameter, um Schmutz und Fremdgeräusche zu eliminieren. Unterscheiden Sie in einem Punktdiagramm, das die FSC-Fläche im Vergleich zur Höhe zeigt, Dubletten von einzelnen Zellen.Nutzen Sie das negative Signal des Viabilitätsfarbstoffs, um lebensfähige Zellen zu isolieren. Vergleichen Sie die Autofluoreszenzkontrolle von ungefärbten Zellen mit Positivkontrollen von gefärbten Zellen, um zu bestätigen, dass die gefärbten Zellen für jeden Parameter richtig skaliert sind. Optimieren Sie die Kompensation, indem Sie mehrfarbige Zellproben analysieren und zwei farbige Punktdiagramme untersuchen.Passen Sie die Kompensationseinstellungen nach oben oder unten an, bis die Zellpopulationen entweder vertikal oder horizontal zueinander ausgerichtet sind. Nutzen Sie CD45- und CD11B-Signale, um zwischen Lymphozyten, Mikroglia, myeloischen Zellen und Astrozyten anhand ihrer spezifischen Expressionsmuster zu unterscheiden. Verwenden Sie Scheinhirngewebe als Autofluoreszenzkontrolle, um als Referenz für die Identifizierung von Lymphozyten zu dienen.Wenn Sie ein bestimmtes Ziel analysieren, verwenden Sie eine FMO-Kontrolle mit Hirngewebe nach einem Schlaganfall. Sammeln Sie die Steuerungsdaten und speichern Sie sie. Sammeln Sie auf ähnliche Weise die Beispieldaten, und speichern Sie sie.Wählen Sie die Zielzellpopulationen aus und sortieren Sie sie entweder in Fünf-Milliliter-Reagenzgläser aus Polystyrol mit rundem Boden oder in konische 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 500 Mikroliter PBS hinzu und spülen Sie das Sammelröhrchen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten und die Pelletbildung zu unterstützen. CCR7-positive und CD11c-positive Mikroglia wurden an den Tagen zwei und sieben nach ischämischem Schlaganfall quantifiziert.Die CCR7-Expression in Mikroglia stieg am zweiten Tag stark an und blieb am siebten Tag im Vergleich zu Scheinkontrollen erhöht. Die CD11c-positiven Mikroglia folgten einem ähnlichen Trend, erreichten am zweiten Tag ihren Höhepunkt und blieben am siebten Tag höher als die Schein-Mikroglia. Dot Plots zeigten dichte CCR7- und CD11c-Signale an den Tagen zwei und sieben.Im Gegensatz zu spärlichen Signalen in Scheinsteuerungen. Eine Gating-Strategie trennte myeloische Mikrogliazellen und Lymphozyten mittels CD11B- und CD45-Expression. Zusätzliche Marker definierten lebensfähige Zellen, Astrozyten und Lymphozyten-Untergruppen.

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Forschung

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Neuroscience

Neurowissenschaften

Filamentous Verschluss der mittleren Hirnarterie ist ein gemeinsames Modell für die Untersuchung einen ischämischen Schlaganfall bei Mäusen.

Modeling Stroke in Mice - Middle Zerebralarterie mit dem Filament-Modell

Verschiedene Mausmodellen der mittleren Hirnarterie (MCAO) sind weit verbreitet in der experimentellen Hirnforschung. Hier zeigen wir das Modell der transkraniellen Dauer distalen MCAO, die im Einklang kortikalen Infarkt von einer Größe, die von der Mehrheit der menschlichen ischämische Schlaganfälle auferlegt Schaden produziert.

Modellierung Schlaganfall bei Mäusen: Permanent Koagulation der distalen A. cerebri media

Gehirn Myeloidzellen Charakterisierung nach Schlaganfall kann durch Stereologie unter Verwendung des optischen Fraktionator Verfahren durchgeführt werden, oder durch eine durchflusszytometrische Analyse von Gehirn Leukozyten Suspensionen. Beide sind nützliche Techniken, um eine genaue phänotypische Unterscheidung der Haupt myeloischen Zellen-Untergruppen in der ischämischen Gehirn führen.

Stereo und Durchflusszytometrie Charakterisierung von Leukozyten-Subpopulationen in Models der vorübergehend oder bleibend zerebrale Ischämie

Dieses Protokoll beschreibt die wiederholte hypoxische Präkonditionierung oder kurze Exposition gegenüber systemischer Hypoxie, die das Infarktvolumen und die Störung der Blut-Hirn-Schranke nach einem vorübergehenden Verschluss der mittleren Hirnarterie bei Mäusen reduziert. Es wird auch die duale Quantifizierung des Infarktvolumens und der Störung der Blut-Hirn-Schranke nach einem Schlaganfall beschrieben, um die Wirksamkeit des neurovaskulären Schutzes zu bewerten.

Die Quantifizierung der neurovaskulären Schutz Nach Repetitive hypoxische Präkonditionierung und Transient mittleren Hirnarterie Occlusion in Mice

Hier stellen wir die Methodik zur Erzeugung eines fokalen Schlaganfalls in der weißen Substanz der Maus durch lokale Injektion eines irreversiblen endothelialen Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS)-Inhibitors (L-Nio) vor. Vorgestellt werden zwei stereotaktische Varianten, die retrograde neuronale Verfolgung und die Markierung und Dissektion von frischem Gewebe, die die Anwendungsmöglichkeiten dieser Technik erweitern.

Ein vielseitiges Mausmodell von Subcortical Weiß Matter Stroke für das Studium der axonalen Degeneration and White Matter Neurobiologie

Entzündung spielt eine zentrale Rolle bei der Pathogenese des ischämischen Schlaganfalls. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass es wie ein zweischneidiges Schwert wirkt, das frühe Hirnverletzungen verschlimmert, aber auch zur späteren Reparatur beiträgt. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn und ihre anschließende durchflusszytometrische Phänotypisierung.

Isolation und Analyse über Durchflusszytometrie von Immunzellen aus dem ischämischen Gehirn der Maus

Um die Pathophysiologie des Schlaganfalls zu verstehen, ist es wichtig, zuverlässige Modelle zu verwenden. Dieses Papier wird eine der am häufigsten verwendeten Taktmodelle bei Mäusen beschreiben, die Arteria cerebri media Okklusion (MCAo) Modell genannt (auch bezeichnet als die intraluminale Faden oder Naht Modell) mit Reperfusion.

Chirurgische Ansatz für Arteria cerebri media Occlusion und Reperfusion fokaler zerebraler Ischämie bei Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Durchflusszytometrie, um die Veränderungen der Immunzellzusammensetzung, des Zytokinprofils und des Chemokinprofils in der pulmonalen Umgebung nach einem vorübergehenden mittleren Hirnarterienverschluss, einem murinen Modell des ischämischen Schlaganfalls, zu identifizieren.

Charakterisierung von Immunzellen und proinflammatorischen Mediatoren im pulmonalen Milieu

Verschiedene Modelle des mittleren Hirnarterienverschlusses (MCAo) werden in der experimentellen Schlaganfallforschung eingesetzt. Hier wird ein experimentelles Schlaganfallmodell der transienten MCAo über die Arteria carotis externa (ECA) beschrieben, das darauf abzielt, den menschlichen Schlaganfall nachzuahmen, bei dem der zerebrovaskuläre Thrombus aufgrund einer spontanen Gerinnsellyse oder -therapie entfernt wird.

Modellierung des Schlaganfalls bei Mäusen: Vorübergehender Verschluss der mittleren Hirnarterien über die Arteria carotis externa

Um die Immunantwort auf Hirnerkrankungen zu untersuchen, ist ein gängiger Ansatz die Analyse von Veränderungen in Immunzellen. Hier werden zwei einfache und effektive Protokolle für die Isolierung von Immunzellen aus murinem Hirngewebe und Schädelknochenmark bereitgestellt.

Isolierung von Immunzellen aus dem Gehirn und dem Schädel von Mäusen

Lernen Sie die Isolierung und durchflusszytometrische Bewertung neuroimmuner Interaktionen in einem Mini-Schlaganfall-Mausmodell. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Analyse immunologischer Reaktionen nach ischämischem Schlaganfall.

Isolierung und durchflusszytometrische Bewertung neuroimmuner Interaktionen in einem Mini-Schlaganfall-Mausmodell

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