Isolierung und durchflusszytometrische Bewertung neuroimmuner Interaktionen in einem Mini-Schlaganfall-Mausmodell
20. Juni 2025
Hier stellen wir ein Protokoll zur Beurteilung der Immunzellfunktion nach ischämischem Schlaganfall mittels durchflusszytometrischer Analyse in einem Mini-Schlaganfallmodell vor. Diese Methode ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der neuroimmunen Interaktionen und kann für die Untersuchung anderer neurodegenerativer Erkrankungen angepasst werden, um unser Verständnis der Immunantworten in der Schlaganfallpathologie zu verbessern.
Der Schwerpunkt unserer Forschung liegt auf der Funktion von Immunzellen nach ischämischem Schlaganfall. Unser Ziel ist es, die Gesetzmäßigkeiten von residenten und infiltrierenden Immunzellen in der Schlaganfallpathologie zu verstehen. Derzeit wird die Durchflusszytometrie häufig eingesetzt, um die Funktion und Wechselwirkungen von Immunzellen bei Neuroinflammationen zu beurteilen.
Darüber hinaus treiben Immuntechniken sowie Einzelzell- und Sequenzierung die Forschung im Bereich der Neuroimmuninteraktionen voran. Unser Labor wird sich auf die Veranschaulichung des Weges von Astrozyten in neuroimmunen Interaktionen und den Beitrag von Angio zu neuroinflammatorischen Prozessen konzentrieren. Nehmen Sie zunächst eine 50-Milliliter-Spritze und befestigen Sie eine 26-Gauge-Nadel an ihrem Ende.
Füllen Sie die Spritze vollständig mit Kochsalzlösung. Positionieren Sie die betäubte Maus in Rückenlage auf einer Schaumstoffplatte. Strecken Sie die Vorder- und Hintergliedmaßen aus und befestigen Sie sie mit 26-Gauge-Nadeln.
Fassen Sie mit einer gezackten Daumenzange die Bauchhaut und machen Sie einen seitlichen Schnitt, um die Leber freizulegen. Schneiden Sie an beiden Seiten der Rippen entlang, um das Herz freizulegen. Führen Sie nun die 26-Gauge-Nadel in den linken Ventrikel ein und trennen Sie das rechte Orakel ab.
Drücken Sie den Kolben der Spritze, damit das Blut abfließen kann. Fahre mit der Perfusion fort, bis das Blut, das aus dem Orakel abfließt, klar erscheint. Nachdem Sie die Maus geköpft und das Gehirn extrahiert haben, übertragen Sie es in eine Gehirnmatrix aus Mausstahl und teilen Sie es in aufeinanderfolgende zwei Millimeter dicke Hornhautscheiben.
Geben Sie 500 Mikroliter der Verdauungsenzymmischung in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte. Trennen Sie das Infarktgewebe mit einer Mikrozange vorsichtig und überführen Sie es in die Verdauungsenzymmischung. Zum Schluss fragmentieren Sie das Gewebe mit einer Augenschere in möglichst kleine Stücke und inkubieren die Platte 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.
Mit der AP 1000 Pipette die Lösung 10 Mal vorsichtig aspirieren und dosieren, um das Gewebe in einzelne Zellen zu dissoziieren. Anschließend wird die Lösung durch ein 70-Mikrometer-Zellensieb geleitet. Spülen Sie sowohl die 12-Well-Platte als auch das Zellsieb wiederholt mit eiskaltem HBSS, das Calcium und Magnesium enthält.
Zentrifugieren Sie nun die gesammelte Zellsuspension bei 500 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören. Suspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter PBS.
Nach Wiederholung des Zentrifugationsvorgangs wird das Pellet erneut in 150 Mikrolitern PBS resuspendiert und die Suspension in eine runde Bodenplatte mit 96 Vertiefungen überführt. Zentrifugieren Sie erneut bei 500 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Fassen Sie nach dem Zentrifugieren die 96-Well-Platte fest an und drehen Sie sie schnell um, um den Überstand zu entsorgen.
Als nächstes verdünnen Sie die Fluoreszenzmatrize der Zellviabilität in einem Verhältnis von eins zu hundert in PBS und resuspendieren Sie das Pellet in 150 Mikrolitern der verdünnten Farbstofflösung. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und dabei die Platte vor Licht schützen. Nach fünfminütigem Zentrifugieren bei vier Grad Celsius wird der Überstand verworfen.
Verdünnen Sie den Antikörper-Cocktail auf der Zelloberfläche in magnetisch aktivierter Zellsortierung oder Max-Puffer und geben Sie den Antikörper-Cocktail in die Vertiefungen, ohne die Zellen zu waschen. Inkubieren Sie 15 bis 20 Minuten bei vier Grad Celsius, bevor Sie weitere fünf Minuten zentrifugieren. Nachdem Sie die Platte zentrifugiert und den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie das Pellet in maximal 150 Mikrolitern Puffer.
Die Suspension wird in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen oder fünf Milliliter Polystyrol-Reagenzgläser mit rundem Boden überführt. Entwerfen Sie ein mehrfarbiges Durchflusszytometrie-Panel entsprechend der Gerätekonfiguration, entweder mit manuellen Methoden oder mit einem Online-Panel-Design-Tool. Fügen Sie einen Zellviabilitätsfarbstoff in das Panel ein, um nicht lebensfähige Zellen und Ablagerungen aus den Daten auszuschließen.
Passen Sie die Einstellungen für den Vorwärtsstreu- und den Seitenstreudetektor an, um sicherzustellen, dass die interessierenden Zellen korrekt angezeigt werden und ordnungsgemäß gesteuert werden können. Feinabstimmung der FSC- und SSC-Parameter, um Schmutz und Fremdgeräusche zu eliminieren. Unterscheiden Sie in einem Punktdiagramm, das die FSC-Fläche im Vergleich zur Höhe zeigt, Dubletten von einzelnen Zellen.
Nutzen Sie das negative Signal des Viabilitätsfarbstoffs, um lebensfähige Zellen zu isolieren. Vergleichen Sie die Autofluoreszenzkontrolle von ungefärbten Zellen mit Positivkontrollen von gefärbten Zellen, um zu bestätigen, dass die gefärbten Zellen für jeden Parameter richtig skaliert sind. Optimieren Sie die Kompensation, indem Sie mehrfarbige Zellproben analysieren und zwei farbige Punktdiagramme untersuchen.
Passen Sie die Kompensationseinstellungen nach oben oder unten an, bis die Zellpopulationen entweder vertikal oder horizontal zueinander ausgerichtet sind. Nutzen Sie CD45- und CD11B-Signale, um zwischen Lymphozyten, Mikroglia, myeloischen Zellen und Astrozyten anhand ihrer spezifischen Expressionsmuster zu unterscheiden. Verwenden Sie Scheinhirngewebe als Autofluoreszenzkontrolle, um als Referenz für die Identifizierung von Lymphozyten zu dienen.
Wenn Sie ein bestimmtes Ziel analysieren, verwenden Sie eine FMO-Kontrolle mit Hirngewebe nach einem Schlaganfall. Sammeln Sie die Steuerungsdaten und speichern Sie sie. Sammeln Sie auf ähnliche Weise die Beispieldaten, und speichern Sie sie.
Wählen Sie die Zielzellpopulationen aus und sortieren Sie sie entweder in Fünf-Milliliter-Reagenzgläser aus Polystyrol mit rundem Boden oder in konische 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 500 Mikroliter PBS hinzu und spülen Sie das Sammelröhrchen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten und die Pelletbildung zu unterstützen. CCR7-positive und CD11c-positive Mikroglia wurden an den Tagen zwei und sieben nach ischämischem Schlaganfall quantifiziert.
Die CCR7-Expression in Mikroglia stieg am zweiten Tag stark an und blieb am siebten Tag im Vergleich zu Scheinkontrollen erhöht. Die CD11c-positiven Mikroglia folgten einem ähnlichen Trend, erreichten am zweiten Tag ihren Höhepunkt und blieben am siebten Tag höher als die Schein-Mikroglia. Dot Plots zeigten dichte CCR7- und CD11c-Signale an den Tagen zwei und sieben.
Im Gegensatz zu spärlichen Signalen in Scheinsteuerungen. Eine Gating-Strategie trennte myeloische Mikrogliazellen und Lymphozyten mittels CD11B- und CD45-Expression. Zusätzliche Marker definierten lebensfähige Zellen, Astrozyten und Lymphozyten-Untergruppen.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Diese Studie stellt ein Protokoll zur Beurteilung der Funktion von Immunzellen nach ischämischem Schlaganfall mittels Durchflusszytometrie in einem Mini-Schlaganfall-Modell vor. Die Methode ermöglicht eine detaillierte Untersuchung neuroimmuner Wechselwirkungen und kann für die Forschung zu verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen angepasst werden, wodurch das Verständnis der Immunantworten bei der Schlaganfallpathologie verbessert wird.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Immunologie
- Schlaganfallpathologie
Hintergrund
- Das Verständnis der Immunantworten beim ischämischen Schlaganfall ist entscheidend für die Entwicklung von Therapien.
- Neuroimmunologische Wechselwirkungen sind ein entscheidender Faktor, der den Schlaganfallverlauf beeinflusst.
- Bestehende Modelle weisen häufig unzureichende Analysemöglichkeiten für Immunfunktionen auf.
- Diese Studie zielt darauf ab, diese Lücke mithilfe der Durchflusszytometrie zu schließen.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Beurteilung der Funktion von Immunzellen nach ischämischem Schlaganfall.
- Untersuchung der neuroimmunen Wechselwirkungen in einem Modell für Mini-Schlaganfall.
- Verbesserung des Verständnisses der Immunantworten bei neurodegenerativen Erkrankungen.
Verwendete Methoden
- Es wurde eine Durchflusszytometrie-Analyse eingesetzt, die eine detaillierte Untersuchung der Funktionen von Immunzellen ermöglicht.
- Ein Mini-Infarkt-Modell wurde verwendet, um ischämische Bedingungen zu simulieren.
- Im Text wurden keine Multi-Omics- oder metabolischen Analyse-Workflows erwähnt.
- Detaillierte Verfahrensschritte, die für das Protokoll relevant sind, wurden nicht bereitgestellt.
- Die Anpassungsfähigkeit der Methode für verschiedene neurodegenerative Erkrankungen wird hervorgehoben.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll ermöglicht die detaillierte Beurteilung der Immunzellantworten nach ischämischem Schlaganfall.
- Die Ergebnisse deuten auf bedeutende Erkenntnisse hinsichtlich neuroimmuner Wechselwirkungen während eines Schlaganfalls hin.
- Die Übertragbarkeit auf andere neurodegenerative Erkrankungen stellt eine zentrale Erkenntnis dar.
- Die Schlussfolgerungen unterstreichen die Bedeutung des Verständnisses immunologischer Dynamiken in der Schlaganfallpathologie.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie demonstriert eine robuste Methodik zur Untersuchung der Immunantworten bei Schlaganfällen.
- Der Ansatz vertieft das Verständnis der für die Neurodegeneration relevanten Immunmechanismen.
- Die Ergebnisse haben Auswirkungen auf die Entwicklung gezielter Therapien im Management von Schlaganfällen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die quantitative, zytometrische Durchflussanalyse neuroimmuner Interaktionen in einem Mini-Stroke-Mausmodell ermöglicht eine präzise Charakterisierung der Aktivierung und Infiltration von Immunzellen nach ischämischer Verletzung. Dieser Ansatz unterstützt die mechanistische Risikominderung und Zielvalidierung bei von Neuroinflammation getriebenen Pathologien und leitet frühe Portfolioentscheidungen in Entwicklungsprogrammen für neurodegenerative und zerebrovaskuläre Erkrankungen ein. Die Anpassungsfähigkeit des Protokolls über verschiedene Krankheitsmodelle hinweg verbessert die translationale Kontinuität und die Vorhersagesicherheit immunmodulatorischer therapeutischer Strategien.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung der neuroimmunen Mechanismen, die ischämischen Schäden und der Neurodegeneration zugrunde liegen.
- Unterstützt die funktionelle Zielvalidierung durch Quantifizierung der Aktivierungszustände von Immunzellen nach Schlaganfall.
- Erleichtert die mechanistische Risikominderung für immunmodulatorische Zielstrukturen bei Erkrankungen des zentralen Nervensystems.
- Liefert Daten zur Bewertung der vorhersagenden Zuverlässigkeit und zur Priorisierung früher Wirkstoffkandidaten.
Screening und Assay-Entwicklung
- Etabliert validierte Workflows für die Herstellung von Einzelzell-Suspensionen und die Antikörperfärbung zur reproduzierbaren Immunprofillierung.
- Liefert quantitative, multiparametrische Messwerte, die für die Standardisierung von Assays und die anschließende Durchmusterung geeignet sind.
- Ermöglicht skalierbare Phänotypisierung von Immunzellen zur Wirkstoffevaluierung in neuroinflammatorischen Kontexten.
- Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform in verschiedenen Modellen neurodegenerativer Erkrankungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Abstimmung der Immunzell-Profilierung mit krankheitsrelevanten Endpunkten in präklinischen Schlaganfall- und Neurodegenerationsmodellen.
- Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung neuroimmunologischer Zielstrukturen.
- Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung basierend auf Parametern der Immunaktivierung und -infiltration.
- Erleichtert die Identifizierung translationaler Biomarker für neuroinflammatorische Prozesse.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll integriert sich in die Kontinuum von der Entdeckung bis zur präklinischen Phase und unterstützt die Zielvalidierung, die Aufklärung immunologischer Mechanismen sowie die Entwicklung quantitativer Assays für Programme zu neuroinflammatorischen und neurodegenerativen Erkrankungen.
- Entdeckungsbiochemie: Bietet belastbare Daten zur Aktivierung und Infiltration von Immunzellen für Hypothesentests und die Aufklärung von Signalwegen.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Ergebnisse zur Immunprofilerstellung für die Bereitschaft von Assays und die Untersuchung von Verbindungen.
- Analysen: Ermöglicht statistische Vergleiche von Immunzellpopulationen über verschiedene experimentelle Bedingungen und Zeitpunkte hinweg.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Abstimmung präklinischer Immunparameter mit krankheitsrelevanten Biomarkern.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet einen standardisierten und anpassbaren Workflow zur Immunprofilerstellung über mehrere Modelle zentralnervöser Erkrankungen hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten bei der Validierung neuroimmuner Zielstrukturen.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Isolierung von Immunzellen und Durchflusszytometrie-Protokolle, um Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit zu gewährleisten.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen und die Kapitalallokation, indem quantitative Metriken zur Immunaktivierung bereitgestellt werden.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Wirkstoffen gegen neuroinflammatorische und neurodegenerative Erkrankungen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Neuroanatomie, Immunzellbiologie und Durchflusszytometrie-Analyse.
- Setzt Zugang zu hochparametrischen Durchflusszytometern und validierten Antikörpanelen voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise bei der Gewebeaufbereitung und Gating-Strategien über mehrere Arbeitsgruppen hinweg.
- Kann an verschiedene Modelle zentralnervöser Erkrankungen angepasst werden, wobei die Protokolle je nach Gewebetyp und Krankheitskontext optimiert werden müssen.
- Die Interpretation der Immunprofildaten erfordert möglicherweise komplementäre funktionelle Assays.
