Erforschung der sequentiellen zellulären Ereignisse der durch Godanti Bhasma ausgelösten Phagozytose in Säugetierzellen

Phagozytose, bei der ein Phagozyt Fremdpartikel aufnimmt und abbaut. Es ist entscheidend für die Immunabwehr. Um diesen komplexen zellulären Prozess effizient zu überwachen und auszuwerten, sind verbesserte benutzerfreundliche Methoden erforderlich.

Die Erfassung von Degradationsereignissen in Echtzeit und die Vermeidung von Artefakten aus dem Photobleaching sind nach wie vor eine zentrale Herausforderung bei der genauen Untersuchung von Phagozytose und intrazellulärem Transport. Im Gegensatz zu fluoreszierenden oder synthetischen Partikeln verwendet unser Protokoll Godanti Bhasma, ein markierungsfreies Partikel, das eine direkte Visualisierung von Phagozytosestadien ohne Photobleichen, Optimierung oder komplexe Präparation ermöglicht. Diese Ergebnisse liefern ein reproduzierbares Modell zur Analyse phagozytärer Mechanismen und bieten neue Werkzeuge zur Untersuchung der vesikulären Dynamik, der Dysfunktion von Krankheitserregern und potenzieller therapeutischer Interventionen bei Immun- und lysosomalen Erkrankungen.

Unser Ziel ist es, die molekularen Regulatoren der Phagosomen der Reifung zu erforschen, phagozytische Dysfunktion in Krankheitsmodellen zu untersuchen und potenzielle Medikamente zu screenen, die die vesikuläre Dynamik und den intrazellulären Transport modulieren. Wiegen Sie zu Beginn genau 100 Milligramm Godanti Bhasma oder GB Pulver. Suspendieren Sie das Pulver in 10 Millilitern DMEM, ergänzt mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin.

Wirbeln Sie die Suspension gründlich vor, um den Inhalt zu mischen, und lassen Sie die Mischung eine Minute lang stehen, damit sich die größeren Partikel am Boden absetzen können. Übertragen Sie mit einer Pipette die oberen fünf Milliliter der Suspension in ein steriles Zentrifugenröhrchen. Markieren Sie die fünf Milliliter der übertragenen GB-Suspension als Stammlösung für weitere Zellkulturen.

Wirbeln Sie die Suspension erneut gründlich ein, um eine gleichmäßige Verteilung der Partikel zu gewährleisten, bevor Sie sie den Zellen zuführen. Seed 3 10 to the fourth power 3T3-L1 Zellen in eine 35-Millimeter-Schale mit zwei Millilitern DMEM setzen. Inkubieren Sie die Schale bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre von 5 % Kohlendioxid, bis die Zellen eine Konfluenz von 70 % erreichen.

Mischen Sie dann 300 Mikroliter der GB-Stammsuspension gründlich in zwei Milliliter vorgewärmtes frisches Nährmedium. Stellen Sie die Kulturschale mit den Zellen und der GB-Suspension auf den Tischinkubator des bildgebenden Mikroskops. Wählen Sie das 10-fach-Objektiv am Mikroskop aus.

Schalten Sie die Hellfeldbeleuchtung mit der Taste Hell ein. Starten Sie dann die DIGI ImagePlus Software und wählen Sie die passende Kamera aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Aufnehmen und wählen Sie die Option Zeitraffer.

Stellen Sie die Intervallzeit auf fünf Minuten ein und starten Sie die Aufnahme, indem Sie auf die Schaltfläche Fertig stellen. Nehmen Sie Hellfeldbilder in Fünf-Minuten-Intervallen ununterbrochen für 16 bis 24 Stunden im Kohlendioxid-Inkubator des Mikroskoptisches auf. Verwenden Sie die ImageJ-Software, um alle aufgenommenen Bilder zu einem Zeitraffervideo zusammenzustellen.

Dies ermöglicht die Identifizierung der Phagozytosestadien von der Partikelinternalisierung bis zu ihrem vollständigen Abbau. Nach 24 Stunden Zellwachstum in 96-Well-Platten mischen Sie die GB-Partikel-Stoffsuspension gründlich. Geben Sie 30 Mikroliter der Suspension in jede Vertiefung.

Verwenden Sie Wells ohne GB-Partikel als Negativkontrollen. Inkubieren Sie die Platten 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid, um die Vakuolenbildung zu induzieren. Um eine neutralrote Lösung herzustellen, lösen Sie Neutralrot auf, um eine Lösung von 0,5 Milligramm pro Milliliter in serumfreiem DMEM herzustellen.

Filtrieren Sie die Lösung durch einen 0,2-Mikrometer-Filter. Entfernen Sie für die Bildgebung das Medium von den 96-Well-Platten. Nachdem Sie 60 Mikroliter des Filterfarbstoffs in jede Vertiefung gegeben haben, inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit PBS, um überschüssige Farbe zu entfernen. Fahren Sie dann mit der mikroskopischen Bildgebung fort. Untersuchen Sie die gefärbten Vakuolen unter einem Mikroskop mit dem 20x-Objektiv, um die Größe, Morphologie und Anzahl der Vakuolen zu beurteilen.

Zur Herstellung von Bafilomycin A1-Stammlösung lösen Sie 100 Mikrogramm der Verbindung in 50 Mikrolitern Dimethylsulfoxid. Dann verdünnen Sie es mit 950 Mikrolitern DMEM. Für die Arbeitslösung wird ein Mikroliter des Stoffes in 1,6 Millilitern DMEM verdünnt, um eine Endkonzentration von 0,1 Nanomolar zu erhalten.

Mischen Sie die Arbeitslösung gründlich und geben Sie 100 Mikroliter in die Vertiefungen mit den Zellen in den 96-Well-Platten. Inkubieren Sie dann die Zellen in jeder Vertiefung mit 30 Mikrolitern GB-Partikelsuspension, um die Hemmung der Vakuolen- und Phagosomenbildung zu untersuchen. Um die Ansäuerung der Phagosomen zu hemmen, geben Sie 100 Mikroliter der Arbeitslösung Bafilomycin A1 in Vertiefungen mit vorgeformten Vakuolen, die zuvor mit GB behandelt wurden. Inkubieren Sie alle Vertiefungen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid.

Geben Sie 60 Mikroliter neutralroten Farbstoff in jede Vertiefung. Inkubieren Sie 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit PBS, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen, und analysieren Sie dann die Vakuolenbildung und -ansäuerung unter dem Mikroskop. Behandeln Sie die kultivierten Zellen mit 50 Mikrolitern GB-Suspension und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid unter Standard-Versuchsbedingungen.

Nach der Behandlung wird den Zellen Acridinorange-Lösung in einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter zugesetzt und 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert, um Vakuolen und saure vesikuläre Organellen zu färben. Waschen Sie die Zellen anschließend dreimal mit sterilem PBS, um ungebundene Farbstoffe zu entfernen und die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren. Analysieren Sie abschließend die gefärbten Objektträger sofort mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einem 20-fach-Objektiv und einem blauen Anregungsfilterbereich von 450 bis 492 Nanometern ausgestattet ist.

Beurteilen Sie die zelluläre Morphologie und die Aufnahme von Acridinorangen, um die Vakuolendynamik zu verstehen. Nach 30-minütiger GB-Behandlung wurden Partikel beobachtet, die an der Oberfläche von drei 3T3-L1-Zellen hafteten. Um das Partikel herum erschien eine becherartige Membranverlängerung, die auf den Beginn der Partikelverschlingung hinweist.

12 Stunden nach der Behandlung wurden große membrangebundene Vakuolen mit GB-Partikeln in den Zellen beobachtet. Die Zeitrafferbildgebung zeigte die schrittweise Internalisierung und Vakuolenbildung in einer einzelnen lebenden Zelle über einen Zeitraum von 4,75 Stunden. GB-Partikel in den Vakuolen wurden im Laufe der Zeit zunehmend abgebaut und die Zelle nahm ihre normale Morphologie wieder an, was durch den Vakuolenumsatz angezeigt wird.

Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass internalisierte Godanti-Bhasma-Partikel innerhalb von 24 Stunden vollständig abgebaut wurden und keine Partikel im Kulturmedium zurückblieben. Die Neutralrotfärbung zeigte eine signifikant höhere Vakuolensäuerung in GB-behandelten Zellen aller drei Zelllinien im Vergleich zu Kontrollen, die nur eine schwache lysosomale Färbung aufwiesen. Die Acridin-Orange-Färbung zeigte eine orange-rote Fluoreszenz in den Vakuolen von GB 3T3-L1-Zellen, die auf eine Versauerung hindeutet, während unbehandelte Zellen nur eine grüne Fluoreszenz zeigten.

Die gleichzeitige Behandlung mit Bafilomycin hemmte die Vakuolenbildung sowohl in 3T3-L1- als auch in HeLa-Zellen, was durch das Fehlen von Vakuolen im Vergleich zu ihren jeweiligen Kontrollen belegt wird. Nach der Behandlung mit Bafilomycin wurde die Aufnahme von Neutralrot wirksam blockiert, wodurch die Vakuolensäuerung und -reifung in den Zellen gestört wurde.