Eine Mixture-Pipeline zur Generierung molekularer operationeller taxonomischer Einheiten (MOTUs) bei Ufer- und Wasserkäfern

Mit dem Ziel, die Artenentdeckung in den MEGA-Tropen zu beschleunigen, zielt dieses Protokoll darauf ab, Hypothesen zur Artenclusterbildung bei Wasser- und Uferkäfern unter Verwendung einer Mischung aus computergestützten Analysen zu erstellen.

Diese Zubereitungspipeline, die die COI-DNA-Sequenz verwendete, führte zu einer größeren Evidenz für eine Artabgrenzung für Flößkäfer aus der Gattung Anisostena, die bisher nur anhand morphologischer Daten aufgestellt wurde.

Dieses Protokoll versucht, das taxonomische Hindernis zu beseitigen, dass die Entdeckung von Arten durch morphologiebasierte Taxonomie, die als Goldstandard in der Insektensystematik gilt, oft zeitaufwändig und verwirrend für wenig untersuchte, aber MEGA vielfältige und sehr unauffällige Wasserkäfer ist.

[Emmanuel] Diese Pipeline generiert molekulare akzessorische Hypothesen, die MOTUs genannt werden, unabhängig davon, ob die Sequenz den bekannten Spezies pro referenzierter Sequenz entspricht oder ob die Spezies unentdeckt oder unbeschrieben sind.

Anstatt Hunderte von Käfer-Genitalstrukturen auf einmal zu sezieren und zu vergleichen, bietet die Pipeline eine vorläufige Clusterbildung, anhand derer Exemplare auf Konspezifität untersucht werden können.

[Erzähler] Starten Sie zunächst MEGA X und laden Sie die DNA-Sequenzen für die Ausrichtung. Öffnen Sie die Achsschnittstelle, indem Sie eine Linie auswählen, dann auf Achse bearbeiten oder erstellen klicken und dann Neue Achse erstellen auswählen. Klicken Sie auf OK, um die Auswahl zu bestätigen, und wählen Sie DNA als Datentyp aus. Bewegen Sie den Mauszeiger über die Registerkarte "Bearbeiten". Klicken Sie auf Sequenz aus Datei einfügen. Navigieren Sie zum entsprechenden Verzeichnis und wählen Sie die Sequenzdateien aus, die in MEGA geladen werden sollen. Klicken Sie nun auf Ausrichtung, wählen Sie dann Ausrichten nach ClustalW, um die Sequenzen mit den Standardeinstellungen auszurichten, und klicken Sie auf OK, um fortzufahren. Um die Sequenzen manuell zu bearbeiten, löschen Sie alle Einfügungen, indem Sie auf die eingefügten Basen oder Positionen klicken und die Entf-Taste auf der Tastatur drücken. Korrigieren Sie als Nächstes Löschungen, indem Sie auf den Bindestrich klicken, der eine fehlende Basis darstellt, ihn entfernen und die gewünschte Basis eingeben. Suchen Sie dann die früheste Position, an der alle Sequenzen ein Zeichen enthalten. Klicken Sie auf das leere Feld in der Zeilenüberschrift direkt links von dieser Position und ziehen Sie, um alle überschüssigen Startpositionen auszuwählen. Drücken Sie die Entf-Taste, um sie zu kürzen. Suchen Sie dann die zuletzt ausgerichtete Position und klicken Sie auf das Feld rechts von diesem Punkt. Drücken Sie erneut die Entf-Taste, um das Ende zu kürzen. Wählen Sie nun alle Sequenzen aus und klicken Sie auf die Registerkarte Übersetzte Proteinsequenzen. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, überprüfen Sie den genetischen Code als wirbelloses Mitochondrial. Wenn der genetische Code unterschiedlich ist, klicken Sie auf Nein und es erscheint ein Menü, in dem Sie das Kontrollkästchen für den mitochondrialen genetischen Code von Wirbellosen ankreuzen können. Wenn Stoppcodons, die mit einem Sternchen in der Ausrichtung markiert sind, in einer ganzen Spalte angezeigt werden, klicken Sie auf DNA-Sequenzen und löschen Sie die erste Position für alle Sequenzen. Klicken Sie erneut auf DNA-Sequenzen und speichern Sie die Ausrichtung im .mos- oder .mosx-Format. Um die Abgrenzung mit dem TaxonDNA-Modul zu starten, öffnen Sie die TaxonDNA-Software. Klicken Sie auf Importieren, wählen Sie dann FASTA aus und laden Sie die Achsdatei im FASTA-Format hoch. Klicken Sie nun auf Module und wählen Sie dann Cluster aus. Legen Sie den Schwellenwert auf 3 % fest, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Individuelle Informationen für jeden Cluster generieren. Klicken Sie auf Jetzt Cluster erstellen, um das Clustering zu starten und die Ergebnisse durch Erstellen eines Screenshots zu speichern. Um die Abgrenzung mit der Kimura 2-Parameter-Methode vorzunehmen, öffnen Sie MEGA, klicken Sie auf Datei und wählen Sie dann Datei oder Sitzung öffnen. Klicken Sie auf Entfernung. Wählen Sie Paarweise Entfernungen berechnen aus, und bestätigen Sie die MEG-Datei für die Abgrenzung. Zeigen Sie mit der Maus auf das Feld neben Modell oder Methode und klicken Sie auf den Pfeil, um das Dropdown-Menü zu erweitern. Wählen Sie das Kimura 2-Parameter-Modell aus und klicken Sie auf OK, um das Programm auszuführen. Öffnen Sie das Datenausgabefenster, um die Ergebnisse anzuzeigen. Klicken Sie auf Datei und wählen Sie dann Exportieren und Entfernungen drucken, um das Ergebnis zu speichern. Öffnen Sie die assemblierte Spezies durch automatische Partitionierung oder ASAP-Webserver. Klicken Sie auf das orangefarbene Kästchen mit der Aufschrift Choose a file (Datei auswählen) und laden Sie die .fasta-Datei hoch. Scrollen Sie nach unten und klicken Sie auf Los. Um das Clustering-Ergebnis herunterzuladen, klicken Sie auf die Liste für die Zeile mit dem niedrigsten ASAP-Score und dem höchsten P-Wert-Rang. Um die Baumschätzung zu starten, öffnen Sie MEGA und klicken Sie auf Daten. Wählen Sie dann Datei oder Sitzung öffnen aus, um die MEG-Datei zu laden. Klicken Sie auf Modelle und wählen Sie dann "Beste DNA- und Proteinmodelle suchen" oder "ml" aus, um das am besten geeignete Substitutionsmodell zu bestimmen. Klicken Sie im Menü "Analyseeinstellungen" auf "OK". Um nun den Baum zu generieren, klicken Sie auf Phylogenie und wählen Sie dann Konstruieren und Testen des Maximum-Likelihood-Baums aus. Verwenden Sie das am besten geeignete Substitutionsmodell, indem Sie auf das Kästchen neben Modell oder Methode klicken und das entsprechende Modell aus dem Dropdown-Menü auswählen. Klicken Sie unter Phylogenietest auf das Kästchen neben dem Phylogenietest und wählen Sie dann die Bootstrap-Methode aus dem Dropdown-Menü. Klicken Sie auf das Kästchen neben der Anzahl der Bootstrap-Replikationen. Geben Sie 1.000 ein, und klicken Sie auf OK, um die Analyse auszuführen. Sobald das Fenster mit der resultierenden Struktur geöffnet wird, speichern Sie die Sitzung als .mts- oder .mtsx-Datei. Speichern Sie die Ausgabe auch als .newick-Datei und exportieren Sie den Baum als .png Bild. Für die PTP-basierte Abgrenzung besuchen Sie den PTP-Webserver. Klicken Sie auf Datei auswählen und laden Sie den Baum im Newick-Format hoch. Unter meinem Baum ist die Option rooted ausgewählt. Geben Sie in das Feld unter den Namen der Außengruppen-Taxa die Außengruppe ein, indem Sie den Namen des Taxon-Tipps eingeben. Klicken Sie anschließend unter Maximum-Likelihood-Lösung auf Abgrenzungsergebnisse herunterladen, um die PTP ML-Ausgabe zu speichern. Klicken Sie auf ähnliche Weise unter der höchsten Bayes'schen unterstützten Lösung auf Abgrenzungsergebnisse herunterladen, um die PTP BI-Ausgabe zu speichern. Informationen zur MPTP-basierten Einschränkung durch MPTP finden Sie auf dem MPTP-Webserver. Laden Sie die Newick-Datei hoch, indem Sie sie auf das graue Quadrat ziehen oder auf das Quadrat klicken. Sobald die Daten geladen sind, klicken Sie auf Weiter zur Outgroup-Auswahl. Wählen Sie auf der Seite mit der Außengruppenspezifikation die Außengruppe aus, indem Sie auf das Kontrollkästchen neben den Taxa-Beschriftungen der Außengruppenexemplare klicken. Klicken Sie dann auf Modellauswahl, wählen Sie MPTP und klicken Sie auf Visualisierungsoptionen. Übernehmen Sie auf der Seite mit den Visualisierungsoptionen die Standardeinstellungen. Klicken Sie auf Senden. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Dateien unter Herunterladbare Dateien und wählen Sie Speichern unter, um die Ergebnisse zu speichern. Um nun die molekularen operationellen taxonomischen Einheiten oder MOTU zu generieren, öffnen Sie den Baum mit einem Bildbearbeitungsprogramm oder PowerPoint. Erstellen Sie einen Balken, um die Ergebnisse der einzelnen Ansätze zur Abgrenzung molekularer Spezies darzustellen. Wenn alle Ansätze für einen gegebenen molekularen Cluster identische Ergebnisse liefern, wird der Cluster im Konsens als MOTU bezeichnet. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse des Maximum-Likelihood-Genbaums und des molekularen Clusterings für Boranuskäfer auf der Grundlage von COI-3-Prime-Sequenzen und sechs Abgrenzungsmethoden. Alle Methoden identifizierten konsistent vier MOTUS, Byrrhinus negrosensis, Byrrhinus villarini, Byrrhinus A und Byrrhinus B mit identischer Clusterbildung über alle Methoden hinweg. Byrrhinus negrosensis und Byrrhinus villarini waren klar voneinander getrennt, obwohl sie von den gleichen Standorten stammten. Sequenzen aus vier Provinzen wurden in Byrrhinus A gruppiert, wobei sie keine starke geographische Strukturierung zeigten. Diese Abbildung zeigt die Gruppierung von Anisostena-Käfern in vier MOTUS, darunter Anisostena angatbuhay, Anisostena auxilium, Anisostena A und Anisostena B mit vollständiger Übereinstimmung zwischen den Methoden. Anisostena auxilium überlappte sich geografisch mit Anisostena A und Anisostena B, was darauf hindeutet, dass die Geographie allein die molekulare Divergenz nicht erklärt.