Im lebenden Organismus Bildgebung der neuronalen Aktivität in nicht anästhesierten erwachsenen Drosophila-Fliegen

Wir versuchen, die molekularen, zellulären und schaltkreisförmigen Grundlagen des natürlichen Gedächtnisvergessens zu verstehen, um herauszufinden, wie das Gehirn aktiv Erinnerungen löscht oder unterdrückt, um die kognitive Flexibilität zu erhalten. Neuere Forschungen haben gezeigt, dass Vergessen nicht nur ein passiver Zerfall von Erinnerungen ist, sondern vielmehr ein hochgradig regulierter aktiver biologischer Prozess, der spezifische Muster neuronaler Aktivität erfordert.

Eine große Herausforderung besteht darin, spezifische Schaltkreismanipulationen mit dynamischen Gedächtnisprozessen zu verknüpfen und gleichzeitig konnektomische, genetische und Verhaltensdaten auf strenge und interpretierbare Weise zu integrieren. Wir halfen bei der Etablierung, dass Vergessen ein aktiver biologisch regulierter Prozess ist. Unsere Arbeit identifizierte spezifische dopaminerge Neuronen und molekulare Signalwege, die für das normale Vergessen im Drosophila-Gehirn erforderlich sind. Unser Protokoll ermöglicht die funktionelle Bildgebung bei Fliegen ohne Anästhesie und verhindert so unerwünschte unspezifische Effekte durch die Anästhetika. Wir verwenden diesen Ansatz, um die neuronalen Korrelate zu untersuchen, die der Gedächtnisbildung und dem aktiven Gedächtnisvergessen zugrunde liegen.

[Erzähler] Schneiden Sie zunächst mit Dremel-Werkzeugen und einem Diamantsägeblatt ein 22-Gauge-Injektionsmetallrohr auf eine Länge von etwa 10 Zentimetern. Polieren Sie mit einer Dremel 420 Trennscheibe beide Enden des Schlauchs, um eine glatte und saubere Öffnung zu schaffen, die den Rüssel der Fliege aufnehmen kann. Wickeln Sie den abgeschnittenen Schlauch um ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, um die gewünschte gebogene Form zu formen. Schneide dann ein 7 Zentimeter langes Stück 12-Gauge-Injektionsmetallrohr ab. Schneide nun mit einer Rasierklinge das Ende einer 2-Mikroliter-Pipettenspitze ab, damit es in den 22-Gauge-Metallschlauch passt. Stecken Sie den 12-Gauge-Schlauch in das andere Ende der Pipettenspitze. Mischen Sie anschließend eine kleine Menge Epoxidharz und Härter zusammen. Tragen Sie das Epoxidharz auf die Verbindungsstellen auf, an denen der kleine Metallschlauch auf die Pipettenspitze trifft und wo der größere Schlauch mit dem anderen Ende verbunden ist. Lassen Sie das Epoxidharz über Nacht vollständig aushärten, bevor Sie die Baugruppe an einen Mikromanipulatorhalter anschließen und den Winkel nach Bedarf anpassen. Um eine Pipette zur Schock- und Geruchsabgabe zu bauen, schneiden Sie 1 Milliliter von einer 1 x 100 Glaspipette an der 3-Milliliter-Markierung mit einem Dremel-Diamantwerkzeug ab. Schneiden Sie dann eine kleine rechteckige Acrylplatte mit den Maßen 24,5 Millimeter x 8 Millimeter mit einer Dicke von 1/8 Zoll zu. Schneide ein kupfernes Stoßgitter aus, das auf das rechteckige Acrylstück passt. Löten Sie zwei elektrische Drähte an gegenüberliegende Enden des Kupfergitters. Lege nun das Kupfergitter auf das Acrylstück und biege es leicht, um es an den Bauch und die Beine der Fliege anzupassen. Verwende Isolierband, um das Kupfergitter an dem Acrylstück zu befestigen. Befestigen Sie dann die Glaspipette mit einer Heißklebepistole am Schockgitter und stellen Sie sicher, dass es gerade und zentriert ist. Um die Aufnahmekammer zu bauen, nehmen Sie einen Glasobjektträger als Kammerbasis. Harz und Epoxidkleber miteinander vermischen. Befestigen Sie Neodym-Magnete mit dem Epoxidkleber an allen vier Ecken einer schwarzen Acrylkammer. Platzieren Sie einen zusätzlichen Magneten auf jedem geklebten Magneten. Kleben Sie dann die neu platzierten Magnete mit Epoxidharz auf einen Glasobjektträger. Halten Sie die Baugruppe während des Aushärtens mit Büroklammern fest. Entfernen Sie die 200-Mikroliter-Pipettenspitze aus dem Aspirator. Setzen Sie den Aspirator in ein Fläschchen mit der Drosophila ein und aspirieren Sie eine einzelne Fliege in die 1.000-Mikroliter-Pipettenspitze. Setzen Sie die 200-Mikroliter-Pipettenspitze wieder auf den Aspirator auf. Blasen und schnippen Sie dann vorsichtig mit dem Aspirator, so dass die Fliege kopfüber an der Oberseite der 200-Mikroliter-Pipettenspitze fixiert ist. Setzen Sie anschließend die Sezierkammer auf den Manipulatorhalter. Schließen Sie das Vakuum an den Fliegenhalteschlauch an und stellen Sie die Durchflussmenge auf ca. 500 Milliliter pro Minute ein. Schieben Sie nun den Vakuum-Metallschlauch in die Mitte des Sichtfeldes des Mikroskops. Saugen Sie den Rüssel der Fliege vorsichtig in den Vakuumhalter ein. Stellen Sie den Manipulator so ein, dass der Kopf der Fliege mit der Kammeröffnung ausgerichtet ist. Schalten Sie die Gleichstromversorgung ein. Tragen Sie mit Platin-Widerstandsdraht geschmolzene Myristinsäure auf, um die Augen und den Thorax an die Kammer zu kleben. Sobald er gesichert ist, trennen Sie den Vakuumschlauch. Entfernen Sie die Aufnahmekammer mit dem Manipulator aus dem Vakuumanschluss und drehen Sie die Kammer auf den Kopf. Kleben Sie dann den Rüssel von unten mit Platinwiderstand fest. Wenn alles verklebt ist, schalten Sie die Gleichstromversorgung aus. Drehen Sie dann die Kammer aufrecht. Befestigen Sie die Kammer an der Glasschiebebasis. Schneide mit einer Schere ein kleines Stück Klebeband ab und lege es vor und hinter den Kopf der Fliege. Drehen Sie die Kammer so, dass der Kopf der Fliege in einem 90-Grad-Winkel zum Experimentator zeigt. Machen Sie mit einer Präpariernadel vertikale Schnitte an den Seiten der Augen. Drehen Sie die Kammer horizontal. Machen Sie dann einen horizontalen Schnitt quer über die Nagelhaut. Geben Sie nun 100 Mikroliter Kochsalzlösung auf den Kopf der Fliege. Entfernen Sie mit einer scharfen Pinzette das Nagelhautfenster und entfernen Sie dann mit der Pinzette das restliche Fett oder die Luftröhre. Platzieren Sie eine vorbereitete Fliege auf dem Mikroskoptisch eines konfokalen Mikroskops, das mit einem Laser und einem Wasserimmersionsobjektiv ausgestattet ist. Passen Sie mit einem Mikromanipulator die Position des Schockgitters und der Geruchspipette so an, dass die Fliege korrekt auf dem Schockgitter positioniert ist. Verwenden Sie den Kurs-Z-Einstellknopf, um durch die z-Achse des Gehirns zu scannen und die gewünschte Gehirnregion zu lokalisieren. Legen Sie die Framegröße auf 512 x 512 Pixel fest. Beginnen Sie mit der Aufnahme von dem Neuron von Interesse mit einem speziell angefertigten oder im Handel erhältlichen Geruchsabgabesystem. Stellen Sie die Aufnahmedauer auf 2 Minuten ein. Starten Sie das Trainingsprotokoll mit dem Geruchsabgabesystem 5 Minuten nach dem Sammeln der Antworten vor dem Training. Zeichnen Sie dann die Reaktionen nach dem Training etwa 5-15 Minuten nach dem Training auf. Der Kalziumindikator GCaMP6f und das rot fluoreszierende Protein tdTomate wurden selektiv im Ausgangsneuron des Pilzkörpers exprimiert, wobei Dendriten in die Gamma- und Alpha-Dash-Lappen des Pilzkörpers projiziert wurden, und das Neuron wurde unter Verwendung der MB077C Split-GAL4-Treiberlinie visualisiert. Die Kalziumreaktionen im Ausgangsneuron des Pilzkörpers auf 3-Octanol waren 5 Minuten nach reversiver Konditionierung ohne Anästhesie signifikant reduziert und blieben nach 15 Minuten unterdrückt. Im Gegensatz dazu waren die Kalziumreaktionen auf 4-Methylcyclohexanol 5 Minuten nach dem Training signifikant erhöht und blieben nach 15 Minuten erhöht. Pseudofarbenbilder zeigten deutliche Fluoreszenzveränderungen vor und nach dem Training. Bei anästhesierten Fliegen waren die Kalziumreaktionen auf CS+ nach dem Training nur teilweise reduziert und die Reaktionen auf CS- unterschieden sich nicht signifikant von den Ausgangswerten. Die quantitative Analyse bestätigte, dass die CS+-Reaktion nach dem Training bei anästhesierten Fliegen signifikant reduziert war, die CS-Reaktionen jedoch statistisch unverändert blieben. Die Plastizität war bei nicht anästhesierten Fliegen signifikant höher als bei anästhesierten.