Wiederverwendbares Leberbildgebungsgerät: Ein wiederverwendbares 3D-gedrucktes Werkzeug für die hepatische intravitale Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das wiederverwendbare hepatische Bildgebungsinstrument, kurz RHIT, als bahnbrechendes Werkzeug zur Erfassung hochwertiger, dynamischer biologischer Daten, insbesondere in der Leberforschung, zu präsentieren. Traditionelle wissenschaftliche Methoden zur Untersuchung von Mäusen in kontrollierten Experimenten basieren seit langem auf Verhaltensbeobachtung, physiologischer Überwachung und genetischer Analyse. Die Komplexität dieser Studien führt häufig zu inkonsistenten oder begrenzten Datenausgaben.

Viele Experimente basieren auf Daten, die entweder unvollständig oder schwer zu interpretieren sind, wie kurze Bilder mit niedriger Auflösung, die schnell verblassen, was es erschwert, langfristige Trends oder subtile Veränderungen zu erfassen. Einführung von RHIT, das eine dynamische, hochauflösende Erfassung für die Leberforschung und darüber hinaus ermöglicht. Die von uns demonstrierende Technik ermöglicht die Herstellung maßgeschneiderter Bildgebungswerkzeuge mit verfügbaren Materialien und weit verbreiteter 3D-Drucktechnologie.

Für den Einsatz in akademischen und ressourcenbegrenzten Umgebungen konzipiert, ermöglicht dieser Ansatz die schnelle Entwicklung und Bereitstellung von Geräten zur Unterstützung hochauflösender In-vivo-Bildgebung. Unser wiederverwendbares Leberbildgebungsinstrument, oder RHIT, wurde entwickelt, um die Gewebestabilität während der intravitalen Mikroskopie der Leber zu verbessern. Das modulare Design von RHIT berücksichtigt Mäuse unterschiedlicher Größe und unterstützt eine erweiterte Bildgebung dynamischer Stoffwechselprozesse mit minimalen physiologischen Störungen.

RHIT wird in einem einzigen Schritt mit Acrylnitril, Butadien, Styrol und ABS hergestellt, einem Thermoplast, der wegen seines geringen Gewichts, seiner Thermostabilität und mechanischen Haltbarkeit ausgewählt wurde. Durch die Anpassung der Materialdichte absorbiert RHIT effektiv Bewegungen, die durch Atmung und Herzschlag verursacht werden, wodurch Bildartefakte reduziert und die Klarheit verbessert wird. Die chemische Trägheit und Wasserunlöslichkeit von ABS gewährleisten die Verfügbarkeit mit biologischem Gewebe und ermöglichen eine effiziente Reinigung und Wiederverwendung.

Um RHIT nachzubilden, verwenden Sie eine 3D-Produktdesign-Software. Für dieses Design wurde der Autodesk Inventor verwendet. Öffne Autodesk Inventor und erstelle ein neues Standardteil.

Speichere die Datei mit der passenden Beschreibung. Erstellen Sie die Skizze von RHIT auf der Frontebene mit der Funktion zum Erstellen von 2D-Skizzen. Klicken Sie auf das Rechteck-Symbol und platzieren Sie dessen untere linke Ecke am Ursprung der Skizzenebene.

Zeichnen Sie ein zweites Rechteck innerhalb des ersten, um das Bildfenster von RHIT darzustellen. Fügen Sie beiden Rechtecken mit der Maßfunktion Maße hinzu, wobei alle Längen und Breiten auf den Ursprung und relativ zueinander bezogen sind. Passen Sie die RHIT-Maße entsprechend der Mausgröße an.

Fügen Sie RHIT Dicke hinzu, indem Sie nur das äußere Rechteck auswählen und die Skizze mit dem Extrudierungswerkzeug extrudieren, um eine Öffnung in der Mitte zu schaffen. Wählen Sie die untere Seite des extrudierten RHIT aus und starten Sie eine neue 2D-Skizze mit der Start-2D-Skizze-Funktion. Zeichne ein Rechteck, um die Tasche für das Wärmekissen zu definieren.

Definieren Sie die Maße des Rechtecks basierend auf Größe und Dicke des Wärmepads, das in diesen Schlitz eingesetzt wird. Diese Messungen sollten mit dem physischen Heizkissen übereinstimmen, um eine genaue Temperaturmodellierung des Säugetiers sicherzustellen. Wenden Sie die erforderlichen Maße mit der Dimensionsfunktion an.

Verlasse die 2D-Skizze und führe eine Materialentfernung mit dem Schneide-Extrudwerkzeug durch, um eine tiefe Höhlung für das Heizkissen zu schaffen. Zoomen Sie bei Bedarf hinein, um die Skizze präzise zu positionieren. Beginne eine neue Skizze für die Temperatursonde auf derselben Seite wie die Höhle.

Klicken Sie auf Start eine 2D-Skizze und wählen Sie das Kreissymbol aus. Platzieren Sie den Kreis auf die ebene Fläche und dimensionieren Sie entsprechend. Verlasse den Skizzenmodus.

Klicken Sie auf Extrude und wählen Sie die Skizze des Kreises aus. Im Extrusionsmodus klicken Sie auf Schneiden, Extrudieren und Entfernen von Material. Setze den Kreis mit dem Tascheneinsatz auf die rechte Seite des Gesichts.

Es muss noch nicht zentriert sein. Füge Maße hinzu, um sie mit dem Zentrum der RHIT-Dicke auszurichten. Klick extrudieren.

Ein Popup erscheint mit einem Pfeil, der die Richtung des Schnitts anzeigt, zusammen mit der Option "Durch alle". Wähle alle aus, um das gesamte Material durchzuschneiden, und klicke dann auf Okay. Beenden Sie den Extrusionsmodus.

Füge Filets an den Rändern des Fensters hinzu, indem du auf das Fillet-Symbol klickst und alle acht scharfen Kanten auswählst. Füge die Fillet-Größe hinzu und verlasse den Fillet-Modus. Bereiten Sie das Modell für den 3D-Druck vor, indem Sie zum Reiter Umgebung navigieren und den Reiter 3D-Drucken auswählen.

Um das unveränderte RHIT zu drucken, importieren Sie die STL-Datei, entweder aus Abbildung 1A oder aus den ergänzenden Materialien, in eine 3D-Druckerbereitungssoftware. Klicken Sie auf Importieren, wählen Sie die Datei aus und klicken Sie auf Bereiten, um das Modell in druckbare Ebenen zu zerlegen. Wählen Sie einen kompatiblen kommerziellen 3D-Drucker und klicken Sie auf Drucken.

Überwachen Sie den Druckprozess. Sobald es fertig ist, entferne und reinige das gedruckte RHIT vorsichtig nach Bedarf. Warte 10 bis 15 Minuten nach den Auswurfen, bevor du mit der Operation und der Bildgebung beginnt.

Mikroskopvorbereitung und Einsatz von RHIT. Bereiten Sie ein herkömmliches invertiertes konfokales Mikroskop für Leber-IBN vor, wie in Abbildung 2A dargestellt. Setze den Stage-Adapter ein, um das Sample aufzunehmen.

Für dieses Protokoll wurde ein maßgefertigter Metalleinsatz mit einer 35-Millimeter-Rundöffnung und einem 40-mm-Abdeckungsglas verwendet. Reinigen Sie beide Seiten des Deckglases vor und nach der Bildaufnahme gründlich und verwenden Sie bei Bedarf 70 % Ethanol. Sichern Sie das passende RHIT basierend auf Mausgröße mit Band, indem Sie die RHIT-Blende mit dem Objektivobjektiv parallel zum Bildabdeckungsschlupf, wie in Abbildung 2G gezeigt, auf dem Metalleinsatz mit Klebeband über dem Abdeckungsglas ausrichten.

Wählen Sie das Objektiv für die Bildgebung basierend auf der Flächengröße, räumlicher Auflösung und Bildzeit, wie z. B. einem 25X-pro-95-Wasser-Objektiv. Richte das Objektiv nahe an das Deckglas aus. Befestigen Sie einen Mullstreifen mit Klebeband über dem nassen Fenster.

Das hilft, das Gewebe zu positionieren und von anderen Bauchorganen zu trennen. RHIT vorzuheizen, indem ein Wärmepad in den Schlitz eingesetzt wird und die Wärmesonde neben dem RHIT befestigt wird, wie in Abbildung 2G bis H gezeigt. Dadurch wird die Körpertemperatur der Maus während der Bildgebung aufrechterhalten. Rasieren Sie das Bauchfell mit einem Haarschneider und/oder einer Haarentfernungscreme.

Entfernen Sie Haarreste und desinfizieren Sie die freiliegende Haut mit 70 % Ethanol. Je nach institutionellen IACUC-Anforderungen kann ein abwechselndes Scrub aus Betadin und Ethanol verwendet werden, um eine angemessene Vorbereitung der Operationsstelle sicherzustellen. Bewerten Sie die Tiefe der Anästhesie vor der Operation am Tier erneut.

Die Leber wird freigelegt, indem man mit einer chirurgischen Schere aus dem Xiphoid einen horizontalen, halbmondförmigen Schnitt von zwei bis drei Zentimeter unter dem Brustkorb macht, der an der linken Seitenseite des oberen Bauches endet. Nach dem ersten Schnitt machen Sie vorsichtig einen kleineren sekundären Schnitt in der Muskelschicht, um den linken Leberlappen freizulegen. Kauterisere bei Bedarf die Blutung, um eine Blutung zu vermeiden.

Vermeiden Sie Hitzeschäden an der Leber während der Verwendung des Kauterisators, indem Sie eine mit Kochsalzlösung getränkte Gaze zwischen Leber und Muskelschicht legen, um die ausgehende Wärme des Muskels aufzunehmen. Vermeiden Sie übermäßige Blutungen, chirurgische oder mechanische Verletzungen oder äußere Kompression. Sobald die Leber freigelegt ist, überführen Sie die Maus in die Mikroskopphase.

Positionierung der Maus auf der Mikroskop-Bühne. Positioniere den Bauch der betäubten Maus nach unten auf der RHIT-Plattform des Mikroskops. Stellen Sie den Nasenkegel so ein, dass die Maus unter Narkose bleibt.

Verwenden Sie einen mit Kochsalzlösung getränkten Applikator mit Baumwollspitze, um den linken lateralen Leberlappen vorsichtig gegen den Deckmantel zu führen, während Sie vorsichtig externen Druck auf die Brusthöhle ausüben. Nutzen Sie die Schwerkraft, um die Leber vorsichtig nach außen und auf das Deckglas zu manövrieren. Verwenden Sie einen Mullstreifen, um die Leber vorsichtig vom Körper der Maus zu trennen.

Überprüfen Sie erneut den Nasenkegel, um sicherzustellen, dass die Maus während der Bildgebenden Narkose bleibt. Verhindern Sie Gewebedehydrierung, indem Sie ein wasserbasiertes Gel an den Rändern der freiliegenden Höhle auftragen und direkten Kontakt mit dem Heizkissen vermeiden. Ein Mikroskop mit geschlossener Feuchtigkeitskammer kann ebenfalls helfen, Temperatur und Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.

Tragen Sie eine Augensalbe auf, um eine Hornhauttrocknung zu verhindern. Setzen Sie schließlich eine Zeitraffer-IVM ein, um mit der Bildgebung zu beginnen. Öffnen Sie Laserverschlüsse, bewerten Sie die fluoreszierende Markierung und identifizieren Sie einen stabilen Bereich von Interesse mit bemerkenswertem Blutfluss.

Wählen Sie geeignete Bildaufnahmen aus, einschließlich Format, Geschwindigkeit, Bildintervalle und Zeitlänge, Bilddurchschnitt usw. Definieren Sie bei Bedarf obere und untere Grenze für Z-Stacks und beginnen Sie mit der Zeitrafferaufnahme. Um unser Protokoll zu validieren, quantifizierten wir die Bildstabilität mithilfe des strukturellen Ähnlichkeitsindex, oder SIM, wie in Abbildung 3D dargestellt.

SIM vergleicht zwei Bilder basierend auf Luminanz, Kontrast und strukturellen Mustern. Ein Wert von eins zeigt perfekte Ähnlichkeit an, während null eine Verzerrung widerspiegelt. Abbildung 3C zeigt, dass RHIT konstant die höchsten SIM-Werte liefert, bis zu 50-mal mehr als kein Insert, was eine bessere Bildqualität zeigt.

In den mit A bis C beschrifteten Bildern verglichen wir die Leber IVM ohne Stabilisator, mit dem Pappeinsatz und mit RHIT. RHIT hält eine klare Auflösung von Lipidtröpfchen in Magenta, Kerne in Grün und Gefäße in Cyan. Schwarz-Weiß-Einsätze heben die Bildstabilität hervor.

RHIT ermöglichte außerdem langfristige IBM bei fettleibigen Mäusen für über acht Stunden, wie im ersten Film gezeigt. Zusammen bestätigten diese Ergebnisse, dass RHIT die Bildqualität und Reproduzierbarkeit über verschiedene Erkrankungen hinweg signifikant verbessert. Insgesamt vereinfacht RHIT das komplexe Setup, das traditionell für hepatisches IBM erforderlich ist, und verbessert sowohl die Reproduzierbarkeit als auch die Zugänglichkeit.

Dieser Ansatz erwartet eine umfassendere Entwicklung hin zur Nutzung des 3D-Drucks zur Standardisierung fortschrittlicher Bildgebungsprotokolle. Über die Leberbildgebung hinaus können die Designprinzipien von RHIT auf andere Anwendungen ausgeweitet werden, darunter Organtomographie, Materialwissenschaft und Ingenieurwesen, bei denen Bewegungsstabilität für die Bildgenauigkeit entscheidend ist.