Simultane 3D-Analyse von Herzschädigung und Immunantwort bei reperfundiertem akutem Myokardinfarkt mittels Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie

Wir schauen uns das Zusammenspiel von Immunzellen und geschädigtem Gewebe nach einem Herzinfarkt an. Unser Ziel ist es, die Immunantwort zu verstehen und die Herzfunktion zu verbessern. Es wurde vorgeschlagen, dass nach einem Myokardinfarkt alle drei großen zellulären Einheiten, Kardiomyozyten und -zellen sowie Immunzellen, gleichzeitig durch Multi-Target-Strategien moduliert werden müssen.

Neben der gleichzeitigen Analyse der Herzschädigung und des Ansprechens konnten wir eine 3D-Lokalisierung dieser geschädigten Bereiche zeigen, die bisher unbekannt war. Die 3D-Analyse, insbesondere beim Multiplexing verschiedener Ziele, bietet eine robustere Möglichkeit, die zelluläre Zusammensetzung nach einem Myokardinfarkt zu beurteilen. Legen Sie die euthanasierte Maus zunächst unter ein Stereomikroskop.

Öffnen Sie mit einer feinen Schere die Brusthöhle und schneiden Sie die freiliegende obere Hohlvene nahe dem Gefäßausgang vom Brustkorb zum Hals an. Mit einer 27-Gauge-Nadel, die an einer Rollenpumpe befestigt ist, wird das Herz in situ über das rechte und linke Vorhoforakel mit heparinhaltigem PBS perfundiert. Bestätigen Sie eine ausreichende Blutentnahme am Herzen, indem Sie das Verblassen der oberflächlichen Gefäßzeichnung des Herzens und das Aufhellen von Lunge und Leber beobachten.

Schneiden Sie das Herz zusammen mit mindestens fünf Millimetern der verbleibenden Aorta und des umgebenden Lungengewebes mit einer Zange und Schere heraus und geben Sie es in eine sechs Zentimeter große Petrischale, die mit eiskaltem PBS und Gaze vorgefüllt ist. Schneiden Sie nun das restliche Lungen-, Fett- und Gefäßgewebe ab, bis nur noch das Herz mit etwa fünf Millimeter Aorta übrig bleibt. Übertragen Sie das Herz in eine Schale, die für die Aortenkanülierung vorbereitet ist, und ziehen Sie die verbleibende Aorta über eine 20-Gauge-Kanüle aus stumpfem Stahl.

Befestigen Sie es mit einer hübschen 5-0-Naht an der Kanülenkerbe. Die linke vordere absteigende Arterie dauerhaft mit einer 6-0-Naht an der Stelle reinigen, die für die Induktion des reperfundierten akuten Myokardinfarkts verwendet wurde. Injizieren Sie 400 Mikroliter PBS mit 20 Mikrogramm NT CD31-Antikörper der Maus, markiert mit einem LexaFluor 546, retrograd über die eingeführte Kanüle.

Ziehen Sie die Kanüle vorsichtig aus der Aorta heraus und überführen Sie das Herz in ein 15-Milliliter-Reaktionsröhrchen aus Polypropylen, das 10 Milliliter 4%-Paraformaldehyd enthält. Inkubieren Sie das Röhrchen über Nacht bei vier Grad Celsius im Dunkeln ohne Rühren. Waschen Sie das fixierte Herz in drei Wechseln von je fünf Millilitern PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln, wobei Sie für das Rühren in Fünf-Milliliter-Polypropylen-Reaktionsröhrchen eine Rotation nahe dem Kopf verwenden.

Dehydrieren Sie das fixierte Herz in fünf Millilitern 50%igem Ethanol in entionisiertem Wasser für mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln und rühren Sie mit nahezu Überkopfrotation in Fünf-Milliliter-Reaktionsröhrchen. Um das dehydrierte Herz zu bleichen, geben Sie es in ein 15-Milliliter-Reaktionsröhrchen, das 10 Milliliter 100 % Ethanol mit 5 % Dimethylsulfoxid und 5 % Wasserstoffperoxid enthält, und inkubieren Sie es bei vier Grad Celsius im Dunkeln für vier Stunden ohne Rühren. Waschen Sie das gebleichte Herz dreimal für jeweils 12 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln in fünf Millilitern 100%igem Ethanol, wobei Sie für das Rühren in Fünf-Milliliter-Reaktionsröhrchen eine Drehung nahe dem Kopf verwenden.

Das Herz wird in ein Fünf-Milliliter-Reaktionsröhrchen mit vier Millilitern Ethylzimat umgefüllt und drei Tage lang ohne Rühren im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Schneiden Sie das gereinigte Gel und die Gummiblöcke auf eine Größe zu, die das gereinigte Herz im Probenhalter des Mikroskops stabilisiert. Verwenden Sie für die Bildaufnahme ein Objektiv mit numerischer Apertur von 0,1 und einem Arbeitsabstand von 17,6 Millimetern.

Erfassen Sie dann die Fluoreszenzsignale mit geeigneten Anregungs- und Emissionsfiltereinstellungen. Wählen Sie für die Lichtblattmikroskopie eine numerische Apertur von 0,079, was zu einer Lichtblattdicke von fünf Mikrometern führt. Stellen Sie den Abstand zwischen zwei einzelnen Z-Ebenen auf 10 Mikrometer ein.

Verwenden Sie eine Blechbreite von 100 %, um eine homogene Ausleuchtung der Probe zu erzielen. In dieser Abbildung sind die repräsentativen Herzschnitte, die den Risikobereich, die Endothelschädigung und die infiltrierten Neutrophilen mittels Mehrkanal-Antikörperfärbung und Autofluoreszenz lokalisieren, dargestellt. Der Risikobereich wurde durch fehlende CD31-Färbung nach retrograder Injektion, endotheliale Schädigung durch intravenöse CD31-Negativität und infiltrierende Neutrophile durch Ly6G-positive Flecken, meist in der Nähe von Verletzungszonen, identifiziert.

3D-Renderings zeigten eine Überlappung zwischen AAR, Endothelverletzung und Neutrophilenclustern, was auf eine regionenspezifische Immunlokalisation hindeutet. Die Quantifizierung zeigte, dass 90,2 % der Neutrophilen in AAR gegenüber 9,8 % in abgelegenen Regionen auftraten, was auf eine lokalisierte Entzündung hinweist. Innerhalb der AAR befanden sich 79,3 % der Neutrophilen außerhalb des endothelialen Verletzungsvolumens und 20,7 % innerhalb des endothelialen Verletzungsvolumens, was auf eine periphere Clusterbildung um die Schädigung hindeutet.