Name: Automatisierte Präparation von 68Ga Ga-3BP-3940 auf einem Synthesemodul für die PET-Bildgebung der Tumormikroumgebung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-25T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Erfahren Sie die automatisierte Radiomarkierung von Gallium-68-3BP3940 für PET-Bildgebung der Tumormikroumgebung. Diese GMP-konforme Methode ermöglicht eine effiziente Synthese in nur 20 Minuten.

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In den letzten Jahren hat die Ausrichtung auf die Tumormikroumgebung (TME) ein erhebliches Interesse an diagnostischen und therapeutischen Anwendungengeweckt 1. Die Fülle an Zelltypen, Signalmolekülen und Makromolekülen der extrazellulären Matrix (ECM) innerhalb des TME bietet ein breites Spektrum an potenziellen molekularen Zielen2. Unter den residenten und infiltrierenden Wirtszellen bilden krebsassoziierte Fibroblasten (CAFs) eine eigenständige Untergruppe von Fibroblasten innerhalb der TME, die sich phänotypisch von normalen Fibroblasten unterscheidet. CAFs spielen durch einzigartige zelluläre und molekulare Eigenschaften eine entscheidende Rolle bei der Tumorprogression, der Metastasierung, der Immunevasion und der Therapieresistenz3. Diese mesenchymalen Zellen weisen einen aktivierten Phänotyp auf, der durch die Expression des Fibroblasten-Aktivierungsproteins (FAP) gekennzeichnet ist. Molekular sezernieren CAFs ein komplexes Array von Zytokinen, Chemokinen, Wachstumsfaktoren (z. B. TGF-β, IL-6 und CXCL12) und EZM-Proteinen (z. B. Kollagen, Fibronektin), die die EZM umgestalten und ein protumorigenes Milieu fördern4.
Als hochspezifisches Protein, das überexprimiert und auf der extrazellulären Oberfläche der CAF-Membran lokalisiert ist, weist FAP alle Eigenschaften eines zuverlässigen molekularen Ziels auf, insbesondere für nuklearmedizinische und radiopharmazeutische Anwendungen5. In diesem Zusammenhang wurden chinolinbasierte niedermolekulare Inhibitoren von FAP (FAPI), funktionalisiert mit einer DOTA-Gruppe, entwickelt und schnell in den klinischen Einsatz eingeführt 6,7,8. Insbesondere FAPI-04 und FAPI-46, die mit Gallium-68 (β+ Emitter, t1/2 = 68 min) für die Positronen-Emissions-Tomographie (PET)-Bildgebung markiert wurden, haben einen signifikanten Wert bei fibrotischen Erkrankungen, in der Kardiologie und Onkologiegezeigt 8,9, insbesondere bei Krebserkrankungen, bei denen [18F]Fluordesoxyglucose ([18F]FDG) einen begrenzten Nutzen hat10. Obwohl ihre Beiträge zur Onkologie und zur Bildgebung nicht-maligner Erkrankungen unbestreitbar sind, weisen niedermolekulare FAPIs gewisse Einschränkungen für Anwendungen in der gezielten Radionuklidtherapie (TRT) auf, insbesondere aufgrund ihrer suboptimalen intratumoralen Verweilzeit, die zu einer unbeabsichtigten Bestrahlung von gesundem Gewebe führen kann11. Um dieses Problem anzugehen, wurden verschiedene Strategien untersucht, wie z. B. das Design multivalenter Liganden 11,12 oder die Verwendung therapeutischer Radionuklide mit kurzen Halbwertszeiten 13,14,15. Außerdem wurden neue molekulare Gerüste entwickelt, die eine hohe Affinität zu FAP aufweisen und einen hohen Anteil an Zellinternalisierung auslösen.
Eines davon ist das Pseudopeptid-Derivat FAP-2286. Es enthält eine 7-Aminosäuresequenz, die cyclisiert und durch eine 1,3,5-Benzoltrimethanthiol-Einheit16 mit einem DOTA-Chelator verbunden ist. Eine erste Studie am Menschen zeigte, dass [68Ga]Ga-FAP-2286 ein ähnliches Bioverteilungsprofil wie [68Ga]Ga-FAPI-46 aufweist, mit einer etwas höheren physiologischen Aufnahme in Leber, Nieren und Herz17. In dieser Studie wurden 64 Patienten, hauptsächlich mit Krebserkrankungen des Halses, der Leber, des Magens, der Bauchspeicheldrüse, der Eierstöcke und der Speiseröhre, einer PET-Bildgebung mit [68Ga]Ga-FAP-2286 zur Krebsstadie oder zum Nachweis eines Rezidivs unterzogen: Die Aufnahme von [68Ga]Ga-FAP-2286 war bei Primärtumoren, Lymphknotenmetastasen und Fernmetastasen deutlich höher als [18F]FDG, was den Bildkontrast und die Läsionserkennbarkeit verbesserte. Alle Primärtumoren waren mit [68Ga]Ga-FAP-2286 PET/CT sichtbar, während [18F]FDG PET/CT fast 20% der Läsionen übersahen. Bei befallenen Lymphknoten waren die Detektionsraten bei [68Ga]Ga-FAP-2286 höher, ebenso bei Knochen- und viszeralen Metastasen. Eine weitere Studie an einer kleineren Gruppe von 21 Patienten mit einer Vielzahl von Krebserkrankungen zeigte ebenfalls die ausgezeichnete Sensitivität dieses bildgebenden Mittels, was die diagnostische Effizienz von [68Ga]Ga-FAP-2286widerspiegelt 18. Spezifischere Studien konzentrierten sich auf eine einzelne Krebsart, wie z. B. Urothel- oder Lungenkrebs, was erneut das hohe Potenzial von [68Ga]Ga-FAP-2286 für die klinische molekulare Bildgebung unterstreicht 4,5. In einer Vorstudie wurde die Anwendung von FAP-2286, das mit Lutetium-177 (β-Strahler, t1/2 = 6,7 d) radioaktiv markiert wurde, bei 11 Patienten mit verschiedenen progredienten, metastasierten Krebserkrankungenuntersucht 19. Die meisten Patienten erhielten zwei Behandlungszyklen im Abstand von 8 Wochen, und die durchschnittlich verabreichte Dosis pro Zyklus betrug 5,8 ± 2,0 GBq [177Lu]Lu-FAP-2286. Das Medikament zeigte eine verlängerte intratumorale Retention mit einer effektiven Halbwertszeit von etwa 44 h bei Knochenmetastasen. Angesichts der akzeptablen Nebenwirkungen ebneten diese Ergebnisse den Weg für größere klinische Studien: Die Sicherheit und Wirksamkeit von [177Lu]Lu-FAP-2286 wird derzeit in der klinischen Phase-1/2-Studie LuMIERE untersucht, die von Novartis gesponsert wird (NCT04939610)7,8. Weitere kleinere Forschungsprotokolle sind in der Literatur dokumentiert 9,20, und es wurden mehrere Fallberichte veröffentlicht 21,22,23,24,25,26, die die Wirksamkeit und hervorragende Verträglichkeit dieser TRT belegen.
Minimale Strukturänderungen, die an FAP-2286 vorgenommen wurden, führten zum optimierten Analogon 3BP-3940 (Abbildung 1)27. Obwohl die wissenschaftliche Literatur zu diesem Vektormolekül nach wie vor begrenzt ist, wurden frühe Studien sowohl für bildgebende als auch für therapeutische Anwendungen durchgeführt. Ein vorläufiger Bericht beschreibt die Anwendung von [68Ga]Ga-3BP-3940 bei 18 Patienten mit verschiedenen metastasierenden Karzinomen im Endstadium und kommt zu dem Schluss, dass dieses Radiopharmakon ein geeignetes PET-Bildgebungsmittel ist, wobei sein hervorragendes Tumor-Hintergrund-Verhältnis und seine sehr geringe Nierenaufnahme hervorgehobenwerden 28. In einer anderen Arbeit erhielt ein einzelner Patient mit Lebermetastasen 150 MBq [68Ga]Ga-3BP-3940 für die PET-Bildgebung, was eine intensive Aufnahme in den Primärtumor und metastasierende Läsionen zeigte29. Derselbe Patient erhielt anschließend eine Einzeldosis von 9,7 GBq [177Lu]Lu-3BP-3940 für TRT. Die Behandlung wurde gut vertragen, es gab keine signifikanten Veränderungen der Vitalparameter oder biologischen Parameter. In einer anderen Studie wurden die ersten humanen Ergebnisse eines theranostischen Ansatzes mit 3BP-3940 vorgestellt: Die Patienten wurden mit einer [68Ga]Ga-3BP-3940 PET-Bildgebung ausgewählt und erhielten dann 3BP-3940, markiert mit verschiedenen Isotopen (177Lu, 90Y oder 225Ac), das allein oder in Tandemkombinationen (z. B. 177Lu + 225Ac) in 1-5 Behandlungszyklen verabreichtwurde 30. Zu den Ergebnissen gehörten eine vollständige Remission, vier partielle Remissionen, drei stabile Erkrankungen und 12 Krankheitsverläufe. Das mediane Gesamtüberleben der Kohorte (n = 28) betrug 9 Monate nach Beginn der TRT.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68356/68356fig01.jpg"> 
Abbildung 1: Chemische Struktur von [68Ga]Ga-3BP-3940. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68356/68356fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Der 68-Ga-Radiomarkierungsprozess für experimentelle Radiopharmazeutika wie FAP-2286 und 3BP-3940 umfasst in der Regel ein Synthesemodul, um den Vorbereitungsschritt zu automatisieren. Insbesondere gewährleistet die Methodenautomatisierung die Robustheit des Prozesses und die GMP-Konformität und minimiert die Strahlenbelastung des Bedieners im Vergleich zu manuellen Präparationsmethoden 31,32,33. In vielen Fällen wird ein solches Protokoll von den Zulassungsbehörden als Teil eines Prüfpräparatedossiers (IMPD) erwartet, bevor sie einem Zentrum die Zulassung zur Herstellung des entsprechenden experimentellen Radiopharmakons erteilen34. Bisher sind in der Literatur nur sehr wenige detaillierte Informationen über die automatisierte 68-Ga-Radiomarkierung von Anti-FAP-Pseudopeptiden verfügbar29,35,36,37,38. Darüber hinaus gelten die berichteten Daten im Allgemeinen nur für ein bestimmtes Synthesizermodell. Die Art des verwendeten 68-Ga-Generators kann auch gewisse Besonderheiten mit sich bringen, da die verschiedenen kommerziell erhältlichen Lösungen durch spezifische Volumina von 68Ga3+ Eluat in HCl (in der Regel 0,1 M) gekennzeichnet sind, was einen direkten Einfluss auf die Bedingungen der automatisierten Radiomarkierung haben kann.
In diesem Zusammenhang stellen wir ein detailliertes Protokoll für die schnelle und effiziente automatisierte Radiomarkierung des Pseudopeptids 3BP-3940 mit 68Ga unter Verwendung des GAIA V2-Synthesemoduls vor. Dieser Synthesizer basiert auf der Verwendung eines Schlauchsets, das aus drei Rampen mit jeweils fünf Verteilern besteht, die mit einer Schlauchpumpe verbunden sind, um den Flüssigkeitsfluss zu steuern. Es verfügt außerdem über einen Vial-Ofen zur Erwärmung des Reaktionsmediums, mehrere Radioaktivitätssonden und einen Drucksensor zur Überwachung dieser Parameter innerhalb des Systems. Obwohl dieser Automat nicht so weit verbreitet ist wie einige andere Modelle, wird er routinemäßig in unserem Zentrum eingesetzt und in einer wachsenden Anzahl von Einrichtungeninstalliert 31,39,40,41,42,43,44. Bei dieser Arbeit wurde ein GALLIAD 68Ge/68Ga-Generator ohne Vorreinigung des 68Ga-Eluats verwendet. Dieses Verfahren soll eine robuste, schnelle und komfortable Lösung für die Herstellung von [68Ga]Ga-3BP-3940 bieten und gleichzeitig den Strahlenschutz für Bediener während der Radiomarkierung optimieren. Dies ist auch das erste Vorbereitungsprotokoll für dieses Radiopharmazeutikum, über das über dieses spezielle Synthesizermodell berichtet wurde, und zwar in so vielen Details.

<table><tbody><tr><td>0,2 & Mikrofilter</td><td>VWR</td><td>514-0515</td><td>Für die Filtration von Puffer- und Antioxidationslösungen und endradioaktivem Markierungsprodukt</td></tr><tr><td>Acetonitril für die HPLC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34851-2,5L</td><td>Für die HPLC-Kontrolle der radiochemischen Reinheit</td></tr><tr><td>Ammoniumacetat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238074</td><td>Für die Vorbereitung einer der mobilen Phasen für die DC-Kontrolle</td></tr><tr><td>C18-Säule für die HPLC</td><td>VWR</td><td>EQV-3C18-1503</td><td>Für die HPLC-Kontrolle der radiochemischen Reinheit</td></tr><tr><td>Kalibrierter Dosiskalibrator (SFC25)</td><td>Capintec-Zur</td> <td>Messung der Radioaktivität des Endprodukts und der verschiedenen Komponenten des Moduls nach der Synthese</td><td></td></tr> <tr><td>Citrat-Pufferlösung, pH 4</td><td>Thermofisher</td><td>258585000</td><td>Mobile Phase für DC-Kontrollen</td></tr><tr><td>Eppendorf-Röhrchen 5 mL Biopur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EP0030119479</td><td>Für die Herstellung von Puffern und antioxidativen Lösungen</td></tr><tr><td>Verlängerungsleitung (30 cm)</td><td>Vygon</td><td>1159.03</td><td>Für den Anschluss des Generators an das Schlauchset</td></tr><tr><td>Gallium-68 Generator</td><td>IRE Elit-Für</td> <td>die In-situ-Erzeugung von [68Ga]Galliumchlorid</td><td></td></tr> <tr><td>Gamma-Zähler (Hidex AMG)</td><td>Hidex-Für</td> die <td>Halbwertszeit und radiochemische Reinheitsbeurteilung</td><td></td></tr> <tr><td>HPLC-Station</td><td>Shimadzu</td><td>-</td><td>Für die HPLC-Kontrolle der radiochemischen Reinheit</td></tr><tr><td>iTLC-SG Platten</td><td>Agilent</td><td>SGI0001</td><td>Für die DC-Kontrolle der radiochemischen Reinheit</td></tr><tr><td>L-Methionin</td><td>AppliChem</td><td>A1340</td><td>Für die Herstellung von Antioxidationslösungen</td></tr><tr><td>Stecker/Stecker Adapter</td><td>Vygon</td><td>893.00</td><td>Für den Anschluss des Generators an das Schlauchset</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320390-1L</td><td>Zur Vorbereitung einer der mobilen Phasen für die DC-Kontrolle</td></tr><tr><td>Nadeln (21G, Sterican)</td><td>B Braun</td><td>4657543B</td><td>Für den Lösungstransfer vor der Radiomarkierung</td></tr><tr><td>pH-Papier</td><td>VWR</td><td>85409.600</td><td>Zur Prüfung des pH-Werts des Radiomarkierungsprodukts</td></tr><tr><td>Pipette 1000 &micro; L (Gilson PIPETMAN)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12346132-1000</td><td>Für präzises Messen und Übertragen von Flüssigkeiten</td></tr><tr><td>Pipette 200 & micro; L (Gilson PIPETMAN)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12326132-200</td><td>Für präzises Messen und Übertragen von Flüssigkeiten</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen, 100-1000 &mu; L</td><td>Charles River</td><td>D1000IW</td><td>Für präzises Messen und Umfüllen von Flüssigkeiten</td></tr><tr><td>Pipettenspitzen, 2-200 &mu; L</td><td>Charles River</td><td>D200IW</td><td>Für die präzise Messung und Übertragung von Flüssigkeiten</td></tr><tr><td>Radiochromatograph</td><td>Elysia-Raytest-Für</td><td></td> <td>die DC-Kontrolle der radiochemischen Reinheit</td></tr><tr><td>Radiosensor für die HPLC</td><td>Elysia-Raytest-Für</td><td></td> <td>die HPLC-Kontrolle der radiochemischen Reinheit</td></tr><tr><td>Reagenzien-Kit</td><td>ABX</td><td>RT-101</td><td>Bietet Ethanol 60%, NaCl 0,9%, WFI-Beutel, C18-Kartusche, 0,2 & Mikro; Endfilter, Belüftungsnadeln, Endnadel und Abfallfläschchen</td></tr><tr><td>Abgeschirmter Behälter</td><td>LemerPax</td><td></td><td>Zur Strahlendämpfung des radioaktiven Markierungsprodukts</td></tr><tr><td>Einweg-Kunststoffspatel</td><td>Corning</td><td>3005</td><td>Zur Herstellung von Reagenzien</td></tr><tr><td>Natriumacetat-Trihydrat EMPROVE</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.28204</td><td>Zur Vorbereitung von Reaktionspuffern</td></tr><tr><td>Steril verschlossene Fläschchen (Glastyp) 1)</td><td>Curium</td><td>TC-ELU-5</td><td>Für die Endkonditionierung von Puffer-, Antioxidations- und Radiomarkierungslösungen</td></tr><tr><td>Sterilschlauchset</td><td>ABX</td><td>RT-01-H</td><td>Für die automatisierte Synthese von [68Ga]Ga-3BP-3940</td></tr><tr><td>Steriles Wasser für die Bewässerung</td><td>B Braun</td><td>0082479E</td><td>Für die Vorbereitung einer der mobilen Phasen für die DC-Steuerung</td></tr><tr><td>Synthesemodul (GAIA)</td><td>Elysia-Raytest</td><td>-</td><td>Für die automatisierte Synthese von [68Ga]Ga-3BP-3940</td></tr><tr><td>Spritze (1 mL, geringes Totvolumen)</td><td>B Braun</td><td>9166017V</td><td>Für Peptid in Puffer, Konditionierung und Zugabe von Methionin in NaCl 0,9 %</td></tr><tr><td>Spritzen (10 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309649</td><td>Für Methionin in NaCl 0,9 % und Konditionierungsspritzen</td></tr><tr><td>(3 mL)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309658</td><td>Für Methionin und Ethanol 60 % Konditionierung</td></tr><tr><td>DC-Migrationstanks</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-212-281</td><td>Für die DC-Kontrolle von radiochemischer Reinheit</td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure (geeignet für HPLC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031-100ML</td><td>Für die HPLC-Kontrolle von radiochemischer Reinheit</td></tr><tr><td>Röhrchen für Gamma-Zähler</td><td></td> <td>-</td> <td>Für die Vorbereitung von Halbwertszeit- und radiochemischen Reinheitsassays</td></tr><tr><td>Ultraschallbad</td><td>Selecta</td><td>3000683</td><td>Für die Beschallung von zubereitete</td></tr><tr><td>Lösungen Vektormolekül (3BP-3940)</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P10131&nbsp;</td><td>Vektormolekül, das radioaktiv markiert werden soll</td></tr><tr><td>Fläschchen für HPLC mit Glaseinsatz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>29385-U und SU860066</td><td>Für die HPLC-Kontrolle von radiochemischer Reinheit</td></tr><tr><td>Vortex-Mischer</td><td>VWR</td><td>444-5900P</td><td>Zum Rühren der vorbereiteten Lösungen</td></tr><tr><td>Wasser für die HPLC Sigma</td><td>Aldrich</td><td>34877-2.5L-M</td><td>Für die HPLC-Kontrolle von radiochemischer Reinheit</td></tr><tr><td>Wasser für Injektionszwecke, 10 mL Kolben</td><td>Aguettan</td><td>34009 370 641 0 1</td><td>Für Lösungen Präparat</td></tr></tbody></table>

automatisierte präparation von [68ga]ga-3bp-3940 auf einem synthesemodul für die pet-bildgebung der tumormikroumgebung

Automated Preparation of [68Ga]Ga-3BP-3940 on a Synthesis Module for PET Imaging of the Tumor Microenvironment

Der auf dem GAIA-Modul entwickelte Syntheseprozess ermöglicht die schnelle 68-Ga-Radiomarkierung von 3BP-3940 in 21-22 min. Dieses Protokoll wurde für die Verwendung mit dem pharmazeutischen 68Ge/68Ga-Generator GALLIAD entwickelt, der 1,1 ml 68Ga-Eluat in 0,1 M HCl produziert. Das Volumen und die Molarität des Reaktionspuffers wurden entsprechend dieser Säuremenge fein abgestimmt, um einen Reaktions-pH-Wert zwischen 3,5 und 4 zu erhalten, der für eine optimale Radiomarkierung e...

Automatisierte Präparation von [68Ga]Ga-3BP-3940 auf einem Synthesemodul für die PET-Bildgebung der Tumormikroumgebung

A fast, efficient method has been developed on the GAIA synthesis module for automated gallium-68 radiolabeling of 3BP-3940, a molecular imaging probe ...

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Chemie

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