Krebsassoziierte Fibroblasten aus Mammatumoren der Maus als Werkzeuge für molekulare und computergestützte Studien

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Kultivierung, Manipulation und Analyse von murinen CAFs, einschließlich funktioneller In-vitro-/In-vivo-Assays , Transkriptomik und computergestützter Analyse. Darüber hinaus wird eine webbasierte Plattform beschrieben, die entwickelt wurde, um die öffentlich zugänglichen Transkriptome von mikropräparierten stromalen und epithelialen Komponenten aus einer Sammlung von menschlichen Brustkrebstumoren zu analysieren.

Unsere Forschung untersucht, wie krebsassoziierte Fibroblasten das Fortschreiten von Brustkrebs beeinflussen, indem wir molekulare, in vitro-, in vivo- und computergestützte Ansätze verwenden, um molekulare Mechanismen zu entschlüsseln und potenzielle therapeutische Ziele zu identifizieren. Neuere Werkzeuge wie Tumororganoide, Einzelzell- und räumliche Transkriptomik verändern die Art und Weise, wie wir die Mikroumgebung von Tumoren modellieren können, und ermöglichen ein präzises und dynamisches Verständnis von Tumorstroma oder Schlaganfällen. Die Krebsforschung ist mit der Heterogenität der Mikroumgebung und der Komplexität des Stroma-Epithels konfrontiert.

Die Resektion sowohl in vitro als auch im Mausmodell kann wichtige molekulare Mechanismen aufdecken, die für therapeutische Eingriffe geeignet sind. Wir haben eine Schlüsselrolle für den Transkriptionsfaktor STAT3 und seine Zielgene bei der Vermittlung der bronchogenen Funktionen von krebsassoziierten Fibroblasten in Brusttumoren etabliert. Wir werden die Vorteile von patientenabgeleiteten Gerüsten nutzen, um die biologische und klinische Relevanz unserer Ergebnisse in einem menschlichen System zu validieren, einschließlich der Induktion von Arzneimittelresistenzen.

Besorgen Sie sich zunächst die für das Experiment erforderlichen Reagenzien und Laborgeräte. Pipettieren Sie 700 Mikroliter supplementiertes DMEM in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte. Platzieren Sie einen Acht-Mikrometer-Transwell-Einsatz in jeder Vertiefung, die für Invasionsassays mit einer biologisch aktiven Matrix beschichtet oder für Migrationsassays unbeschichtet ist.

Übertragen Sie dann die Platte zum Ausgleich in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator. Besorgen Sie sich nun eine 100-Millimeter-Schale mit 4T1-Zellen, die 48 Stunden lang mit immortalisiertem, krebsassoziiertem Fibroblasten-konditioniertem Medium vorbehandelt wurden. Pipettieren Sie einen Milliliter fünfmillimolares EDTA in die Schale, um die Zellen zu lösen.

Geben Sie dann fünf Milliliter vollständiges DMEM in die Schüssel. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Rohr, um die Zellen zu pelletieren.

Resuspendieren Sie das Pellet in zugesetztem DMEM. Zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer-Kammer. Pipettieren Sie 100 Mikroliter der vorbereiteten Zellsuspension in die obere Kammer jedes Transwell-Einsatzes.

Als Plattierungskontrolle werden 100 Mikroliter derselben Zellsuspension in eine 24-Well-Platte mit 500 Mikrolitern vollständigem Medium ausgesät. Beschriften Sie die Oberseite jedes Einsatzes mit einem dünnen Marker. Tauchen Sie die Einsätze zum Waschen mit einer Pinzette in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, das mit PBS gefüllt ist.

Reinigen Sie dann mit einem Wattestäbchen vorsichtig den inneren Teil des Transwells. Legen Sie jeden Einsatz unter einen Abzug in 700 Mikroliter 4%-Paraformaldehyd und inkubieren Sie. Waschen Sie dann die Einsätze, indem Sie sie dreimal in 700 Mikroliter PBS geben.

Nachdem Sie sie 10 Minuten lang trocknen gelassen haben, inkubieren Sie die Einsätze in 700 Mikrolitern 0,1 % Kristallviolett für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Tauchen Sie die Einsätze mit einer Pinzette dreimal in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit doppelt destilliertem Wasser. Trocknen Sie die Innenseite mit einem Wattestäbchen.

Lagern Sie die Proben vor der Bildgebung bis zu drei Tage lang bei Raumtemperatur. Mit einem Phasenkontrastmikroskop. Nehmen Sie ein Bild mit einem 10-fachen Objektiv auf, um den größten Teil der Bohrlochoberfläche zu visualisieren.

Nehmen Sie Bilder von fünf unabhängigen Bereichen der Membran mit einem 20X-Objektiv auf. Fügen Sie Essigsäure hinzu, um das Kristallviolett aufzulösen. Für Vertiefungen fügen Sie 100 Mikroliter 10%ige Essigsäure hinzu.

Auf einem Orbitalschüttler 10 Minuten bei Raumtemperatur mixen. Verlegen Sie die Querträger mit der Unterseite nach oben. 50 Mikroliter Essigsäure auf die Oberfläche geben und durch Pipettieren mischen, bis sich der Farbstoff aufgelöst hat.

Übertragen Sie 50 Mikroliter des gelösten Kristallvioletts aus jeder Probe zur spektrometrischen Analyse auf eine 96-Well-Platte. Öffnen Sie am Tag 21 nach der Injektion in einem Abzug die Brusthöhle einer euthanasierten, tumorinjizierten BALCB/C-Maus mit einer chirurgischen Schere. Entferne die Haut aus dem submandibulären Bereich und den Speicheldrüsen, um die Luftröhre deutlich freizulegen. Bereiten Sie eine 22-Gauge-Nadelspritze vor, die mit 4 % Paraformaldehyd gefüllt ist.

Führen Sie die Nadel in die Luftröhre ein und richten Sie sie auf die Lunge, während Sie die Luftröhre in Richtung Kopf klemmen. Injizieren Sie die Lösung langsam, bis die Lunge anschwillt, in der Regel mit etwa zwei Millilitern Lösung. Präparieren Sie die Lunge und geben Sie sie in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit 4 % Paraformaldehyd.

Drehen Sie dann das Rohr einige Male vorsichtig um. Inkubieren Sie die Lunge 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius, um eine Fixierung vor dem Schneiden und Färben zu ermöglichen. Greifen Sie auf die MetaLCM-Anwendung für die Analyse von transkriptomischen Datensätzen von mikrodissezierten Brusttumoren mit Lasererfassung zu.

Um mit der Analyse zu beginnen, wählen Sie die Features aus, die die zu vergleichenden Bedingungen darstellen. Wählen Sie die Vergleichsrichtung, indem Sie entweder hochregulierte oder herunterregulierte Gene auswählen. Wenn hochregulierte Gene ausgewählt sind, klicken Sie auf Ausführen, um Gene mit höherer Expression in Bedingung eins anzuzeigen.

Wählen Sie nun den p-Wert-Schwellenwert für differenzielle Ausdrücke aus. Drücken Sie die Schaltfläche Ausführen, um die Analyse jedes Mal auszuführen, wenn ein Parameter angepasst wird. Um die Analyse auf eine bestimmte Genliste zu beschränken, geben Sie Gensymbole durch Kommas getrennt ein oder laden Sie eine CSV-Datei mit Gensymbolen in einer einzigen Spalte hoch.

Drücken Sie auf Genliste senden, um die Gensymbole in die Analyse zu laden. Drücken Sie dann Zurücksetzen, um alle Gene zu analysieren. Speichern Sie die resultierende Tabelle der differentiell exprimierten Gene, die die durchschnittliche Änderung der logarithmischen Faltung, den reduzierten p-Wert und detaillierte Werte für jeden Datensatz enthält.

Die Behandlung mit konditioniertem Medium aus superaktivierten immortalisierten krebsassoziierten Fibroblasten (ICAFs) erhöhte die Proliferation von 4T1-Zellen im Vergleich zum Kontrollmedium signifikant. ICAFs-konditioniertes Medium verdoppelte die Migrationskapazität von 4T1-Zellen im Vergleich zur Kontrolle. Eine moderate, aber signifikante Zunahme der Invasion wurde bei 4T1-Zellen beobachtet, die mit ICAFs-konditioniertem Medium behandelt wurden, im Vergleich zur Kontrolle.

Die Co-Injektion von ICAFs mit 4T1-Zellen bei Mäusen erhöhte das Tumorvolumen bis zum Tag 10 signifikant im Vergleich zur alleinigen Injektion von 4T1-Zellen. Das Tumorgewicht war bei Mäusen, die gleichzeitig mit ICAFs und 4T1-Zellen injiziert wurden, signifikant höher als bei Mäusen, die nur mit 4T1-Zellen injiziert wurden. Das Vorhandensein von ICAFs führte zu einem erheblichen Anstieg der Lungenmetastasen bei Mäusen, was sich in einem höheren Prozentsatz der Knötchenfläche pro Lungenabschnitt zeigte.

Vier STAT3-regulierte Gene, MMP13, MMP3, LGI2 und TIMP1, waren im Tumorstroma menschlicher Brustkrebsproben im Vergleich zum normalen Stroma konsistent hochreguliert.