Isolierung, Kultur und Charakterisierung von Prostatakrebs-assoziierten Fibroblasten

Dieses Protokoll bietet ein umfassendes Verfahren zur Isolierung, Expansion und Immortalisierung von Fibroblasten aus radikalen Prostatektomien. Darüber hinaus werden Assays beschrieben, die entwickelt wurden, um die funktionellen Effekte des Fibroblasten-Tumorzell-Crosstalks zu bewerten, wobei sowohl die Behandlung mit konditioniertem Medium als auch die Co-Kultivierung genutzt werden.

Unser Ziel ist es, den Mechanismus zu verstehen, durch den krebsassoziierte Fibroblasten zur Tumorprogression bei Prostatakrebs beitragen, mit dem Ziel, diesen Crosstalk als therapeutische Strategie zu neutralisieren. Unterschiedliche Populationen von CAFs mit unterschiedlichen Eigenschaften können in 3D-Organoiden bewertet werden, die unter Verwendung von Tumor- und Stromazellen nach verschiedenen Manipulationen erhalten wurden. Unser Protokoll ermöglicht es, CAFs für diese Zwecke zuverlässig zu generieren.

Die größten Herausforderungen sind die zuverlässige Isolierung von Tumor- und normalen Zellen aus der Mikroumgebung desselben Patienten, die Heterogenität, das Fehlen spezifischer CAF-Marker, die Plastizität der CAFs und die begrenzten in vitro-Modelle, die die TME-Komplexität rekapitulieren. Mit ähnlichen Methoden haben wir die fundamentale pro-tumorale Rolle des Transkriptionsfaktors STAT3 und seiner Zielgene in murinen Brustkrebs-CAFs charakterisiert und ihre Wirksamkeit als therapeutische Ziele nachgewiesen. Eine optimale Isolierung von Fibroblasten aus dem Tumor und den angrenzenden normalen Regionen von radikalen Prostatektomieproben wird von Prostatakrebspatienten unter Verwendung einer kleinen Menge des Gewebes gewonnen.

Wiegen Sie zunächst die Gewebeproben am ersten Tag auf der Waage für die Fibroblastenisolierung. Übertragen Sie das Gewebe mit einer sterilen Pinzette in sechs Zentimeter große Schalen. Waschen Sie das Tuch zweimal in vier Millilitern eiskaltem PBS und zweimal in vier Millilitern eiskaltem Complete DMEM.

Übertragen Sie nun das Taschentuch in eine sechs Zentimeter große Platte auf Eis. Geben Sie einen Milliliter mit Antibiotikum angereichertes DMEM auf den Teller. Zerkleinern Sie dann das Gewebe mit einer Schere oder Klinge in Fragmente, die kleiner als ein Quadratmillimeter sind.

Übertragen Sie das zerkleinerte Gewebe in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit fünf Millilitern eiskaltem, vollständigem DMEM. Dann zentrifugieren Sie die Suspension bei 754 g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand mit einer 10-Milliliter-Pipette.

Das Pellet in fünf Millilitern eiskaltem DMEM resuspendieren und erneut zentrifugieren. Nach Entfernen des Überstands das Pellet in Kollagenase-II-Lösung resuspendieren. Übertragen Sie die Suspension in 1,5 Milliliter Mikroröhrchen.

Verschließen Sie die Mikroröhrchen mit Paraffinfolie. Legen Sie sie dann bei 37 Grad Celsius für die Verdauung über Nacht unter ständigem Schaukeln für acht bis 12 Stunden. Am nächsten Tag werden die aufgeschlossenen Proben in konische 15-Milliliter-Röhrchen überführt.

Pipettieren Sie fünf Milliliter eiskaltes vollständiges DMEM, um die Kollagenase zu inaktivieren. Dann zentrifugieren Sie die Suspension bei 754 g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter 0,05%Trypsin-EDTA, nachdem Sie den Überstand herauspipettiert haben.

Fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit gelegentlichem Schütteln inkubieren. Anschließend einen Milliliter frisch zubereitete DNase I-Lösung in die Proben pipettieren und gut mischen. Nach dem Zentrifugieren und Entfernen des Überstands das Pellet in fünf Millilitern kaltem vollständigem DMEM resuspendieren und erneut zentrifugieren.

Resuspendieren Sie die resultierenden Zellen in vollständigem DMEM, das mit 20 % fötalem Rinderserum ergänzt wird. Plattieren Sie die Zellen und inkubieren Sie sie mindestens drei Tage lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit. Untersuchen Sie die Zellen nach drei Tagen auf Morphologie und Lebensfähigkeit.

Sobald die Zellen die Konfluenz erreicht haben, werden sie in eine 10 Zentimeter große Schale gegeben, die vollständiges DMEM mit 20 % fötalem Rinderserum enthält. Platten Sie krebsassoziierte Fibroblasten oder normale Fibroblasten mit einer Konfluenz von 70 % in 12-Well-Platten. Am nächsten Tag fügen Sie 0,45 Gramm Agar mit niedrigem Schmelzpunkt zu 12,5 Millilitern PBS in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen unter sterilen Bedingungen hinzu.

Die Mischung in der Mikrowelle auflösen. Kühlen Sie die Agarlösung auf 37 Grad Celsius ab. Dann im Verhältnis eins zu vier mit vorgewärmtem vollständigem DMEM verdünnen, um eine Arbeitslösung herzustellen.

Saugen Sie das Medium aus der 12-Well-Platte an. Pipettieren Sie 500 Mikroliter der Arbeitsagarlösung in jede Vertiefung. 20 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren, um eine Verfestigung des Agars zu ermöglichen.

In der Zwischenzeit die restliche Agarlösung bei 37 Grad Celsius halten. Trypsinisieren Sie die Tumorzellen und bereiten Sie eine Zellsuspension von 20.000 Zellen pro Milliliter her. Mischen Sie gleiche Volumina der Tumorzellsuspension und der Agarlösung, um ein Endvolumen von sieben Millilitern zu erhalten, wobei drei technische Replikate pro Bedingung berücksichtigt werden.

Pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um eine gleichmäßige Mischung zu gewährleisten. Geben Sie dann 500 Mikroliter dieser Mischung mit etwa 5.000 Zellen auf die erstarrte Basisschicht in jeder Vertiefung ab. Nachdem Sie den Agar 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius fest werden gelassen haben, geben Sie einen Milliliter vollständiges DMEM in jede Vertiefung.

Wechsle das Medium jeden zweiten Tag, indem du vorsichtig vom Rand der Vertiefung absaugst und frisches Medium in die Mitte gibst. Inkubieren, bis die Kolonien gut sichtbar werden. Sobald die Kolonien sichtbar sind, entsorgen Sie das Nährmedium.

Färben Sie dann die Kolonien mit 200 Mikrolitern Nitroblau-Tetrazoliumchlorid-Lösung. Über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator inkubieren. Entsorgen Sie am nächsten Tag die Färbelösung.

Nehmen Sie Bilder von gefärbten Kolonien mit einem Stereomikroskop auf. Reine Fibroblasten wurden erfolgreich isoliert. In vielen Fällen, insbesondere in den frühen Passagen, zeigten krebsassoziierte Fibroblasten im Vergleich zu normalen Fibroblasten eine spindelartigere Morphologie.

Die quantitative Analyse bestätigte, dass die Proliferation von DU145-Zellen, die mit krebsassoziierten Fibroblasten-konditionierten Medien behandelt wurden, über 120 Stunden signifikant höher war als bei solchen, die mit normalen Fibroblasten-konditionierten Medien behandelt oder unbehandelt gelassen wurden. DU145-Zellen, die direkt mit krebsassoziierten Fibroblasten und normalen Fibroblasten kokultiviert wurden, zeigten im Vergleich zu den Kontrollen ebenfalls eine erhöhte Proliferation über 96 Stunden. Entsprechende Wachstumskurven zeigten, dass die Co-Kultur mit krebsassoziierten und normalen Fibroblasten im Laufe der Zeit zu einem ähnlichen Anstieg der DU145-Proliferation führte.

Die Wirkung konditionierter Medien auf die DU145-Proliferation variierte zwischen krebsassoziierten Fibroblastenpaaren und normalen Fibroblastenpaaren, wobei frühe Passagepaare signifikant stärkere Effekte zeigten als spätere. In Assays zur Bildung von Weichagar-Kolonien erhöhten sowohl krebsassoziierte als auch normale Fibroblasten die Anzahl und Größe der DU145-Kolonien im Vergleich zu Kontrollen, was auf ein verbessertes verankerungsunabhängiges Wachstum hinweist. Abgelöste Fibroblastenschichten, die sich aufgrund technischer Probleme gebildet hatten, verhinderten bei einigen Replikaten die Koloniebildung.

Konditionierte Medien allein förderten die verankerungsunabhängige Koloniebildung in DU145-Zellen nicht.