Umweltproben von photosynthetischen Mikroben und ihren Viren: Vom Feld ins Labor

Das Ziel dieser Projekte ist es, physiologische Parameter bei Virusinfektionen zu quantifizieren und dann ohmsche Substrate auf die beobachtete Physiologie abzubilden, was zu Modellen oder Gesetzen in der Virologie führt, die Veränderungen in der Virus-Wirt-Dynamik vorhersagen. Mit Fortschritten in der Hochdurchsatz-Sequenzierung und optimierten bioinformatischen Arbeitsabläufen sind multiohmsche Analysen leicht zugänglich, was die Möglichkeit bietet, physiologische Phänomene in Abhängigkeit von spezifischen ohmschen Substraten zu erklären. Mit Hilfe von experimentellen Infektionen, Elektronenmikroskopie, quantitativer PCR-Next-Generation-Sequenzierung und robusten Bioinformatik-Pipelines können Netzwerkanalysen Beziehungen zwischen Ohmik und physiologischen Variablen identifizieren, die die Entwicklung von Vorhersagemodellen beeinflussen.

Die größte Herausforderung besteht darin, reine Virusstämme mit einem einzigen Genotyp mit genauen Titern zu generieren, so dass die Multiplizität der Infektionen für experimentelle Infektionen bestimmt werden kann. Die Titerbestimmung ist nach wie vor ein Thema in der Virologie. Wir haben Metriken entwickelt, um die relative Virulenz zwischen zwei Viren, die einen Wirt infizieren, oder einem Virus, der verschiedene Wirte infiziert, bei Einzelwirts-/Einzelvirusinfektionen zu berechnen.

Wir haben einen Workflow standardisiert, der über Virensysteme hinweg funktioniert. Führen Sie zunächst Umweltproben vor der Küste Südkaliforniens durch. Befestigen Sie einen 10 Fuß langen, kollabelsicheren Gummiflexschlauch am Auslass der Pumpe.

Stecken Sie das Netzkabel der Transferpumpe in den Inverter-Generator. Nach dem Zusammenbau die Förderpumpe ansaugen und testen, ob das Pumpensystem betriebsbereit ist. Befestigen Sie ein Ende eines 25 Meter langen Marineseils aus Nylon mit einem Durchmesser von 1,25 Zentimetern an der Öse eines 14 Kilogramm schweren Pilzankers.

Befestigen Sie das Seil alle drei Meter mit Klebeband an dem blauen PVC-Schlauch. Sobald ein stetiger Wasserfluss übertragen wird, lassen Sie ein bis zwei Rohrvolumen zurück in den Ozean, um sicherzustellen, dass Wasser aus der gewünschten Tiefe durch die Pumpe fließt. Sammeln Sie Wasserproben in 20-Liter-Wasserkrügen, um sie zur Feldstation zu transportieren.

Filtern Sie die Wasserprobe durch eine Filterbecherbaugruppe und schließen Sie den Filterbecher dann mit einem durchsichtigen Vinylschlauch an eine tragbare Luftmembran-Vakuumpumpe an. Übertragen Sie die Probe in den Filterbecher und beginnen Sie mit der Filtration. Wenn Sie fertig sind, füllen Sie das Filtrat in eine Wasserauffangflasche und beschriften Sie es.

Schneiden Sie nun mit einem Skalpell den Filter aus der Filterbecherbaugruppe aus. In zwei Hälften schneiden und in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben. Füllen Sie 50 Milliliter des gefilterten Meerwassers in dasselbe Zentrifugenröhrchen um.

Um gemischte Proben für jede Probenahmetiefe und jeden Standort zu konzentrieren, wird das Ultrafiltrat mit einem mit Zellresten beladenen 0,45-Mikrometer-Filter zurück ins Labor und zur Zentrifuge zurückgeschickt. Füllen Sie 60 Milliliter des Filtrats in einen Schleuderfilter um. Zentrifugieren Sie es bei 6.000 g für 10 bis 20 Minuten, um es zu konzentrieren.

Wiederholen Sie die Zentrifugation, bis ein Konzentrat von 1,5 bis 2 Millilitern des Virus oder der Bakteriophagensuspension erhalten ist. Das resultierende Konzentrat wird in ein Zwei-Milliliter-Eppendorf-Röhrchen überführt, um Viren oder Bakteriophagen aus der aufbereiteten Umweltprobe elektronenmikroskopisch abzubilden. Streichen Sie Umweltproben auf vorbereitete Agarplatten.

Um einzelkolonischige Isolate von mutmaßlichen Virus- oder Bakteriophagenwirten zu isolieren, verwenden Sie eine sterile Impfschlaufe, um ein Isolat auf eine neue Platte zu übertragen. Verwende dann die gleiche Schlaufe, um eine andere Kolonie zu entnehmen und sie in einen Konuskolben mit flüssiger Brühe zu füllen. Bereiten Sie 10 Samenkulturen in 20-Milliliter-Kulturröhrchen vor, die fünf Milliliter BG 11-Medien enthalten.

Fünf Milliliter einer Mischung aus Ultrafiltrat von der Probenstelle und BG-11 werden zugegeben. Entnehmen Sie ein einzelnes Kolonieisolat aus einer Kulturplatte mit einem sterilen Zahnstocher und impfen Sie dann jedes Röhrchen einzeln, indem Sie einen Zahnstocher in jedes Röhrchen fallen lassen. Sobald ein positives Wachstum der Samenkultur festgestellt wird, wiederholen Sie die Streifenverfahren, bis nur noch ein einziger Kolonie-Phänotyp auf den Platten erscheint.

Sobald die Zyklen der Flüssigkultur und der Feststoffplatte zu einem einzelnen Zellphänotyp führen, charakterisieren Sie mikrobielle Morphotypen mit Hilfe der Lichtmikroskopie. Um die Virusaktivität nachzuweisen, züchten Sie mutmaßliche Wirtsrasen mit Cyanobakterien oder Mikroalgen aus Arbeitsbeständen auf BG-11-Agarplatten. Sobald einzelne Plaques auf den Platten erscheinen, die von Flecken auf der Virussuspension herrühren, verwenden Sie eine sterile Schlaufe, um eine einzelne Plaque abzukratzen.

Schwenken Sie die Schlaufe in einer 10-Milliliter-Samenkultur des Wirts. Um das Wirtsspektrum zu bestimmen, bereiten Sie Rasenflächen mehrerer mutmaßlicher Wirte vor, die aus Umweltproben isoliert oder aus anderen Laboratorien oder Kultursammlungen gewonnen wurden. Generieren Sie Wirtswachstumskurven, indem Sie die optische Dichte bei 730 Nanometern in regelmäßigen Zeitabständen von infizierten und nicht infizierten Kulturen messen.

Reinkulturen photosynthetischer Mikroorganismen zeigten unter Lichtmikroskopie unterschiedliche Morphologien. Basierend auf morphologischen Merkmalen und einer 16S rRNA-Sequenzierung, gefolgt von einer phylogenetischen Analyse, wurde das Isolat als eine Art von Cyanobakterien aus der Familie der Merismo PDAC identifiziert. Ein alternatives Isolat mit ovalen grünen Zellen deutet auf Synechococcus hin.

Der Synechocystis-ähnliche Stamm SWII bildet dichte, gleichmäßige Rasenflächen auf BG-11-Agar, ideal für plattenbasierte Plaque-Assays. Die FSBL 14-Infektion verursachte eine sichtbare Plaque-Beseitigung in Swirl-on-Rasen-Serienverdünnungs-Plaque-Assays und behinderte das Wachstum des Stammes SWII in Flüssigkulturen. Die Wachstumskurven zeigten, dass SWII, die mit konzentrierter phi SBL 14-Suspension infiziert waren, einen viel langsameren Anstieg der optischen Dichte aufwiesen als sowohl die verdünnte Phagensuspension als auch die nicht infizierte Kontrolle.

Die maximale spezifische Wachstumsrate war in nicht infizierten SWII-Kulturen am höchsten. Die Transmissionselektronenmikroskopie infizierter SWII-Kulturen zeigte zytopathische Effekte wie Membranverdickung, interne Granula und Membranblasen, die bei nicht infizierten Kontrollen nicht vorhanden waren.