Herstellung eines SARS-CoV-2 Virus ähnlichen Partikelsystems zur Untersuchung viraler Lebenszyklen in vitro

Wir stellen ein optimiertes In-vitro-Protokoll zur Herstellung von SARS-CoV-2-Virus-ähnlichen Partikeln vor, die das authentische Virus genau nachahmen. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung von Virusinfektions-, Assemblierungs- und Austrittsmechanismen, ohne dass ein Labor der Biosicherheitsstufe 3 erforderlich ist.

Unsere Forschung konzentriert sich auf das Verständnis der Biologie des SARS-CoV-2-Virus und versucht, Medikamente, insbesondere aus der chinesischen Medizin, gegen SARS-CoV-2 zu finden. Alle Studien zu lebenden SARS-CoV-2-Viren müssen in einem Labor der Biosicherheitsstufe drei kontrolliert werden. Und diese experimentelle Einschränkung macht eine SARS-CoV-2-Studie nur in einer Handvoll Leben durchführbar. Die SARS-CoV-2-Virus ist eine praktische Methode der Studie über SARS-CoV-2, die ohne Einschränkung des Labors der Biosicherheitsstufe drei möglich ist, und die Liste wird eine sehr nützliche Methode sein.

[Dozent] Zu Beginn säen Sie etwa 3 Millionen HEK-293T-Zellen in einer Gewebekulturplatte mit einem Durchmesser von 10 Zentimetern mit DMEM-Komplettmedium aus, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin. Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für etwa 24 Stunden. Überprüfen Sie die Kofluenz der Zellen unter dem Mikroskop. Verdünnen Sie 60 Mikroliter PEI aus einer Stammlösung von einem Milligramm pro Milliliter mit serumfreiem Medium, um ein Endvolumen von 200 Mikrolitern zu erreichen. Nehmen Sie nun 200 Mikroliter serumfreies Medium und fügen Sie 6,7 Mikrogramm N-Plasmid, 10 Mikrogramm Luc-T20-Plasmid, 0,016 Mikrogramm S-Plasmid und 3,3 Mikrogramm M-IRES-E-Plasmid hinzu. Die verdünnte PEI-Lösung wird vorsichtig in die Lösung gegeben, die die Plasmide enthält, die Proteine mit Virusstruktur überziehen, und die Mischung 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Dies ist die Transfektionslösung. Lassen Sie die Transfektionslösung vorsichtig auf die HEK-293T-Zellen fallen und schwenken Sie die Gewebekulturplatte vorsichtig, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten. Tauschen Sie das Zellkulturmedium sechs Stunden nach der Infektion gegen das DMEM-Komplettmedium aus und inkubieren Sie die transfizierten HEK-293T-Zellen 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Sammeln Sie den Überstand der infizierten HEK-293T-Zellen, der die SARS-CoV-2-Virus-ähnlichen Partikel enthält. Filtrieren Sie den gesammelten Überstand durch einen 0,45-Mikrometer-Spritzenfilter, um Zelltrümmer zu entfernen. Dies ist das SC2-VLP-Medium. 40.000 HEK-293T-Zellen mit stabiler Expression des Angiotensin-Converting-Enzyms 2 oder ACE2 aussäen und in eine 96-Well-Platte TMPRSS2, und 50 Mikroliter SC2-VLP-Medium hinzufügen. Inkubieren Sie die 96-Well-Gewebekulturplatte 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium aus jeder Vertiefung der 96-Well-Platte und waschen Sie es einmal mit 100 Mikrolitern PBS, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Lysieren Sie die mit ACE2-TMPRSS2-Zellen besiedelten HEK-293T-Zellen mit 20 Mikrolitern passivem Lysepuffer und schütteln Sie die Probe 15 Minuten lang bei Raumtemperatur vorsichtig auf einem Orbitalschüttler. Drehen Sie die 96-Well-Platte 15 Minuten lang bei 4.000 g bei vier Grad Celsius mit einer gekühlten Mikrotiterplatten-Zentrifuge und geben Sie die Platte dann sofort in ein Eisbad. Nehmen Sie 100 Mikroliter rekonstituierten Luciferase-Assay-Puffer in eine neue undurchsichtige weiße 96-Well-Platte und geben Sie 20 Mikroliter Lysat in jede Well. Mischen Sie kurz, indem Sie zwei- bis dreimal auf und ab pipettieren. Messen Sie das Lumineszenzsignal mit einem Plattenlesegerät. Um die Zusammensetzung des SC2-VLP-Mediums zu beurteilen, fügen Sie als nächstes 1,36 Milliliter PEG 8000-Lösung zu 10 Millilitern SC2-VLP-Medium hinzu. Gib die Mischung auf einen Orbitalschüttler und mixe sie langsam bei vier Grad Celsius über Nacht. Zentrifugieren Sie die Lösung 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius und 2.000 g. Und sammeln Sie das SC2-VLP-Pellet für die Western-Blotting-Analyse. Säen Sie etwa 3 Millionen HEK-293T-Zellen gleichmäßig in einer Kulturschale mit Glasboden und einem Durchmesser von 15 Millimetern aus und lassen Sie die Zellen anhaften und wachsen, bis sie eine Konfluenz von etwa 70 % erreichen. Nach der Durchtrennung der Zellen, wie zuvor gezeigt, mit den modifizierten Plasmidmengen, waschen Sie die Kulturschale zweimal vorsichtig mit einem Milliliter eiskaltem PBS. Einen Milliliter 4%ige Paraformaldehyd-Fixierlösung bei Raumtemperatur zugeben und 15 Minuten inkubieren. Waschen Sie die Zellen zweimal für jeweils fünf Minuten mit einem Milliliter PBS bei Raumtemperatur und permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie 10 Minuten lang einen Milliliter 0,25% Triton X-100 hinzufügen. Waschen Sie die Zellen erneut zweimal für jeweils fünf Minuten mit einem Milliliter PBS bei Raumtemperatur. Fügen Sie dann eine Stunde lang einen Milliliter 5 % Rinderserumalbumin hinzu, um unspezifische Antikörperwechselwirkungen zu blockieren. Fügen Sie etwa 200 Mikroliter Primärantikörperlösung hinzu, um den Glasboden zu bedecken, und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie dann die primäre Antikörperlösung und waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils fünf Minuten mit einem Milliliter PBS bei Raumtemperatur. Geben Sie nun eine fluoreszenzkonjugierte Sekundärantikörperlösung hinzu und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Nachdem Sie die Zellen dreimal mit PBS gewaschen haben, färben Sie die Zellkerne fünf Minuten lang mit 2,5 Mikrogramm pro Milliliter Hoechst-Lösung bei Raumtemperatur. Beobachten Sie schließlich nach dem Waschen der Zellen mit PBS die Färbung des S-Proteins oder der Organelle, bevor Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop aufnehmen. Diese Abbildung veranschaulicht die Empfindlichkeit der SC2-VLP-Produktion gegenüber unterschiedlichen Transfektionsmengen des Plasmids, das für das Spike-Protein kodiert. Der SC2-VLP-Titer war am höchsten, wenn 0,016 Mikrogramm des S-Plasmids transfiziert wurden, und nahm mit 0,16 und 1,6 Mikrogramm des s-Plasmids signifikant ab. Die H1271-zu-E-Mutation im Spike-Protein reduzierte den SC2-VLP-Titer im Vergleich zum Wildtyp signifikant. Die E1262-zu-H-Mutation führte zu einer moderaten Reduktion des SC2-VLP-Titers, während die E1262-zu-H-, H1271-zu-E-Doppelmutation die Produktion vollständig aufhob. Die S- und S-2-Proteinbanden in voller Länge waren in den E1262- bis H- und Doppelmutanten-Lanen im Vergleich zum Wildtyp verringert. Die Packungseffizienz von S wurde auch in den Mutanten von E1262 zu H und von H1271 zu E reduziert und in der Doppelmutante nahezu aufgehoben. Die VLP-Häufigkeit blieb bei allen Wildtyp- und allen S-Mutanten weitgehend unverändert. Das Wildtyp-S-Protein ist mit dem cis-Golgi-Marker GM130 kolokalisiert, jedoch nicht mit dem ER-Marker Sec61 beta oder dem ERGIC-Marker ERGIC 53. Das H1271 bis E mutierte S Protein zeigte eine diffuse zytoplasmatische Verteilung und es fehlte eine Kolokalisation mit GM130.