Eine schrittweise Anleitung zur Isolierung und Analyse von Blattoberfläche und apoplastischer RNA mit Hilfe von Arabidopsis-Rosetten

Wir versuchen zu verstehen, wie Pflanzen ihr Mikrobiom regulieren und ob RNAs, die von Pflanzen sezerniert werden, die Genexpression sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Mikroben regulieren, die Pflanzen besiedeln. Wir verwenden eine Kombination aus hochauflösender Schalenelektrophorese und Illumina-basierter Analyse, um die auf der Blattoberfläche vorhandenen RNAs zu beurteilen und zu beurteilen, wie sie sich als Reaktion auf biotischen Stress verändern. Während neuere Studien darauf hindeuten, dass extrazelluläre RNAs von pilzlichen und bakteriellen Krankheitserregern aufgenommen werden, sind die zugrundeliegenden Mechanismen der RNA-Aufnahme und die funktionellen Folgen dieser Aufnahme weitgehend unerforscht.

Nimm zu Beginn sechs bis sieben Wochen alte Arabidopsis-Pflanzen für jedes Replikat. Geben Sie Silhouette L-77 in das sterile VIB, bevor Sie mit der Isolierung der Blattoberflächenreinigung beginnen. Anschließend werden mit einem Messzylinder 100 Milliliter der vorbereiteten VIB-Lösung in eine 500 Milliliter Sprühflasche überführt.

Lösen Sie die Arabidopsis-Rosetten vorsichtig mit einer feinen Schere von ihren Wurzeln. Verwenden Sie danach eine weiche Bürste, um überschüssige Erde von den Blütenblättern zu entfernen. Legen Sie die abgelösten Rosetten mit der abaxialen Fläche nach oben auf ein flaches Tablett.

Sprühen Sie dann die abaxiale Oberfläche mit fünf Pumpstößen der mit VIB und Netzmittel gefüllten Sprühflasche ein. Drehen Sie die Rosetten vorsichtig um und sprühen Sie die adaxiale Fläche ein. Bereiten Sie modifizierte Spritzen mit Löchern am Boden vor, indem Sie sie mit Para-Folie um den Hals wickeln, um die Spitze über dem Boden der Flasche aufzuhängen.

Um die Blattoberflächenwäsche wiederherzustellen, führen Sie die gesprühten Rosetten vorsichtig in die nadellosen modifizierten 60-Milliliter-Spritzen ein, die in 250-Milliliter-Zentrifugenflaschen platziert sind, und sprühen Sie zwei feste Pumpstöße Puffer in die Spritze. Anschließend zentrifugieren Sie die beladenen Flaschen bei 100 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Filtern Sie nun die zurückgewonnene Blattoberfläche, waschen Sie sie durch einen 0,22-Mikrometer-Spritzenfilter und sammeln Sie das Filtrat in einem 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, das auf Eis gehalten wird.

Für die Blattoberflächenabstrichmethode besprühen Sie die abgelösten Rosetten mit dem VIB und der Netzmittellösung auf die gleiche Weise wie im vorherigen Schritt beschrieben. Um den Tupfer auf der Blattoberfläche zu gewinnen, verwenden Sie sterile Wattestäbchen, um sowohl die adaxiale als auch die abaxiale Oberfläche der Rosetten abzutupfen. Drücken Sie dann die eingeweichten Spitzen gegen die Innenwand eines 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchens, um die Flüssigkeit zu extrahieren.

Filtrieren Sie die extrahierte Blattoberflächenabstrichprobe durch einen 0,22-Mikrometer-Spritzenfilter in ein zwei Milliliter-Röhrchen, das auf Eis gestellt wird. Legen Sie die gleichen Pflanzen, die zuvor für die Oberflächenreinigung oder die Tupferisolierung verwendet wurden, in ein sauberes Becherglas und spülen Sie sie vorsichtig zweimal mit destilliertem Wasser ab. Um die Rosetten mit VIB zu vakuuminfiltrieren, legen Sie die gespülten Rosetten vorsichtig in eine French-Press-Kaffeemaschine mit 300 bis 500 Millilitern VIB.

Sichern Sie den Deckel und senken Sie den Kolben vorsichtig ab, bis die Rosetten vollständig eingetaucht sind. Setzen Sie die French Press in eine Vakuumkammer ein und legen Sie mit einer Vakuumpumpe 20 Sekunden lang ein Vakuum an, bis die Pflanzen gut infiltriert sind. Nachdem Sie das Vakuum gelöst haben, nehmen Sie die French Press aus der Kammer und nehmen Sie den Deckel ab.

Gießen Sie das VIB in ein 500 Milliliter Becherglas und entfernen Sie die Rosetten. Schütteln Sie dann vorsichtig die Rosetten und streichen Sie die Blätter über ein Papiertuch, um überschüssigen Puffer zu entfernen. Tupfen Sie nun mit Löschpapier vorsichtig die Blattoberflächen ab, um den restlichen Puffer zu entfernen.

Um die aplastische Waschflüssigkeit aufzufangen, führen Sie die VIB-infiltrierten Rosetten in nadellose 60-Milliliter-Spritzen ein, die wie zuvor in 250-Milliliter-Zentrifugenflaschen gelegt werden. Zentrifugieren Sie die Flaschen bei 600 g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius mit langsamer Beschleunigung. Filtrieren Sie dann die gepoolte aplastische Waschflüssigkeit durch einen 0,22-Mikrometer-Spritzenfilter in einem 15-Milliliter-Röhrchen, das auf Eis gestellt wird.

Bereiten Sie ein Mini-Gel vor oder kaufen Sie es, das entweder 10 oder 15 % Polyacrylamid und sieben molaren Harnstoff in Trisborsäure-EDTA-Puffer enthält, unter Verwendung einer Acrylamid- und Bis-Lösung. Mischen Sie dann die RNA-Proben mit zweifachem denaturierendem Ladepuffer. Die Mischung fünf Minuten lang bei 65 Grad Celsius erhitzen und sofort auf Eis legen.

Lösen Sie nun die RNA-Proben in 0,5-fachem FSME-Laufpuffer bei Raumtemperatur auf, indem Sie ca. eine Stunde und 15 Minuten lang 220 Volt anlegen. Färben Sie dann das Gel mit Cyber Gold Nukleinsäure-Gel-Färbung in 0,5-facher FSME für 10 Minuten. Spülen Sie das Gel zweimal mit destilliertem Wasser ab und bilden Sie es mit einem Bildgebungssystem ab.

Um die aufgelösten RNA-Banden zu quantifizieren, verwenden Sie die Gelanalysemethode aus der Dokumentation zu Bild J im Menü Analyse und Gelanalyse. Bereiten Sie RNA-Standards für zwei technische Replikate vor, indem Sie die Zelllysat-RNA in RNase- und DNase-freiem Wasser verdünnen. Um eine 1,5-fache Cyber-Gold-Nukleinsäure-Gelfärbung herzustellen, lösen Sie sie in 500 Millimolar Tris HCL-Puffer bei einem pH-Wert von acht auf.

Geben Sie für die Mikroplatte 99 Mikroliter destilliertes Wasser in jede Vertiefung. Fügen Sie als Nächstes einen Mikroliter RNA zu jeder Vertiefung hinzu, wobei Sie das gleiche Volumen für RNA-Proben und -Standards verwenden. Zum Schluss gibst du 50 Mikroliter Cyber-Gold-Lösung in jede Vertiefung.

Um die Parameter des Mikroplatten-Readers einzustellen, wählen Sie entweder lineares oder orbitales Schütteln für drei Sekunden. Stellen Sie den Mikroplatten-Reader auf den Fluoreszenz-Endpunktmodus mit einer Anregungswellenlänge von 496 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 540 Nanometern ein. Erstellen Sie eine Kalibrierungslinie unter Verwendung der Fluoreszenzintensitätswerte aus den RNA-Standards.

Die Analyse von denaturierendem RNA-Gel zeigte, dass sowohl Blattoberflächenwaschproben als auch aplastische Waschflüssigkeitsproben ein breites Spektrum an RNA-Größen enthalten, einschließlich langer und kleiner RNA-Spezies. Die Gesamt-RNA-Mengen, die aus der aplastischen Waschflüssigkeit und der Blattoberflächenwäsche isoliert wurden, waren ähnlich, wenn sie auf das Frischgewicht der Pflanze normiert wurden. Die RNA-Profile der Blattoberflächenwäsche, der aplastischen Waschung und des Zelllysats unterscheiden sich deutlich, was eine minimale intrazelluläre RNA-Kontamination bestätigt und zeigt, dass aplastische RNA hochgradig prozessiert ist, wobei die Zugabe von 0,001 %Silhouette L-77 zum Vesikelisolationspuffer die RNA-Ausbeute von Blattoberflächen im Vergleich zum Puffer ohne Netzmittel fast verdoppelt.

Eine Erhöhung dieser Konzentration auf 0,01 % verbesserte die RNA-Rückgewinnung jedoch nicht weiter. Eine zweite Wäsche der gleichen Blätter gewann etwa 63 % der in der ersten Wäsche erhaltenen RNA zurück, was auf eine anhaltende RNA-Sekretion auf der Blattoberfläche hinweist. Die RNA-Quantifizierung unter Verwendung von fluoreszenzbasierten Mikrotiterplatten-Assays zeigte eine hohe Linearität mit der RNA-Konzentration sowohl für Cyber-Gold- als auch für RIBO 488-Nachweismethoden.

Wir haben gezeigt, dass tRNA und tRNA-abgeleitete Fragmente (TDRs) in extrazellulärer RNA besonders häufig vorkommen, wahrscheinlich aufgrund ihrer Resistenz gegen Abbau. Wir glauben also, dass diese TDRs wahrscheinlich die Genexpression in Bakterien regulieren. Wir möchten die zellulären Quellen der Blattoberflächen-RNA und die biologische Rolle identifizieren, die diese Blattoberflächen-RNase im Zusammenhang mit geplanten Mikrobeninteraktionen spielen könnte.