Ganzgenom-Deoxyribonukleinsäureextraktion aus Mycobacterium-Arten mittels der Cetyltrimethylammoniumbromid-Technik

Unsere Forschung konzentriert sich auf die genetische Charakterisierung mykobakterieller Arten und die komplexe Natur mykobakterieller Erkrankungen beim Menschen. Wir legen besonderen Wert auf Nicht-Tuberkulose-Mykobakterien und deren Wechselwirkungen mit Makrophagen während der Koinfektion mit anderen Arten, insbesondere Mikrobakterien-Tuberkulose. Darüber hinaus konzentrieren wir uns auf die Artbildung pathogener Mykobakterien, die Identifizierung virulenzassoziierter Gene und den Einzelnukleotid-Polymorphismus, der mit Arzneimittelresistenz verbunden ist.

Aufgrund der dicken Zellwand, lipidischen und hydrophoben Zellwände der Mykobakterien ist die DNA-Extraktion schwierig und erfordert spezialisierte Lysetechniken, um sie abzubauen und die genomische DNA effizient freizusetzen. In unserem Protokoll behandeln wir die DNA-Extraktion aus Mykobakterienarten mit der CTB-Methode als robuste und effektive Methode, um hochwertige DNA herzustellen, die für alle Genomsequenzierungen und andere molekulare Techniken geeignet ist. Zu Beginn töten Sie die Flüssigkeitskultur, die in einem 15-Milliliter-Röhrchen bei 80 Grad Celsius aufgenommen wird, eine Stunde lang.

Dann setze das 15-Milliliter-Rohr in die Zentrifuge und drehe bei 3.220 G 15–30 Minuten bei Zimmertemperatur. Mit einer sterilen Pipette entsorgen Sie das klare Supernatant und stellen Sie sicher, dass das gesamte Medium entfernt wird. Ziehen Sie das Kulturpellet gründlich in 300 Mikrolitern Tris-EDTA-Puffer wieder auf und übertragen Sie das resuspendierte Pellet in ein 2-Milliliter-Rohr.

Geben Sie nun 100 Mikroliter Lysozymlösung mit einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter in die Tube und mischen sie fünfmal durch Pipettern auf und ab. Klopfen Sie vorsichtig auf das Rohr, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten, und stellen Sie das Rohr bei 37 Grad Celsius in einen Rotationsinkubator und bebrüten Sie es über Nacht. Am folgenden Tag bereiten Sie eine Mischung aus 5 Mikrolitern Proteinase K mit einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter und 70 Mikrolitern mit 10 % SDS vor.

Fügen Sie jeder Probe 75 Mikroliter dieser Mischung hinzu. Mischen Sie die Probe, indem Sie das Rohr anklopfen, und inkubieren Sie bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten, wobei Sie das Röhrchen intermittierend invertieren oder anklopfen, um zu mischen. Als Nächstes werden 100 Mikroliter 5-molare Natriumchlorid zur Probe gegeben, gefolgt von 100 Mikrolitern vorgewärmter CTAB-Natriumchloridlösung, die auf eine Temperatur von 65 Grad Celsius vorgeheizt wurde.

Mische die Probe durch Klopfen, bis die Lösung milchig wird. Stellen Sie das Rohr für 10 Minuten in einen Inkubator bei 65 Grad Celsius und wenden Sie das Rohr zwischendurch auf dem Kopf oder tippen Sie es zum Mischen an. Fügen Sie nun ein gleiches Volumen, etwa 675 Mikroliter, Chloroform-Isoamylalkohollösung im Verhältnis 24:1 zur Probe hinzu und mischen Sie sie durch Abklopfen.

Lege die Probe in eine Zentrifuge und lasse sie bei 12.000 G für 10 Minuten bei Zimmertemperatur drehen. Dann aspirieren Sie mit einer Pipette vorsichtig zwischen 550 und 600 Mikroliter der wässrigen Oberphase in sterile 1,5-Milliliter-Schläuche und beschriften sie entsprechend. Geben Sie 550–600 Mikroliter eiskaltes Isopropanol zu jedem Rohr und mischen Sie den Inhalt mehrmals, indem Sie das Rohr umdrehen.

Stellen Sie die Tube in einen auf 20 Grad Celsius eingestellten Gefrierschrank und inkubieren Sie sie 30 Minuten bis eine Stunde. Anschließend zentrifugieren Sie das Rohr mit höchster Geschwindigkeit, etwa 21.130 G, für 30 Minuten bei Raumtemperatur, um die unlösliche DNA zu pelletieren. Mit einer Pipette wird das Supernatant von der Vorderseite des Röhrchens abgesaugt, ohne das DNA-Pellet zu stören.

Gib nun 1.000 Mikroliter eiskaltes 75%-Ethanol zum Pellet und mische die Probe, indem du das Rohr mehrmals umdrehst. Zentrifugieren Sie die Probe bei 12.000 G für 30 Minuten in derselben Ausrichtung wie zuvor verwendet. Nach der Zentrifugation wird das gesamte Ethanol abgesaugt oder dekantiert, ohne das Pellet zu stören.

Lassen Sie das Rohr über Nacht oder mindestens 30 Minuten bei Zimmertemperatur an der Luft trocknen. Dann gibt man zwischen 25 und 50 Mikroliter Tris-EDTA-Puffer bei pH 8 dazu, um die DNA neu zu suspendieren, und legt das Rohr über Nacht bei 4 Grad Celsius. Nach der Qualitätskontrolle werden Sie das Rohr in einen auf 80 Grad Celsius eingestellten Gefrierfach zur Langzeitlagerung gelegt.

Die mit der CTAB-Extraktionsmethode gewonnene DNA-Erträge lag zwischen 190 und 600 Nanogramm pro Mikroliter. Das Absorptionsverhältnis von 260/280 lag zwischen 1,9 und 2,0, das Verhältnis von 260/230 zwischen 1,8 und 2,2, was auf DNA mit hoher Reinheit hinweist. Ein einzelner Absorptionspeak wurde bei 260 Nanometern nachgewiesen.

Die Agarosegel-Elektrophorese hochwertiger Proben zeigte ein deutlich intaktes, hochmolekulares DNA-Band mit minimalem Abbau. Bei einigen nicht-tuberkulosehaltigen Mycobacterium-Arten lag die DNA-Ausbeute unter 50 Nanogramm pro Mikroliter, und die Reinheitsverhältnisse lagen unter dem idealen Bereich, was auf eine Kontamination hindeutet.