Messung von zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP) in festen Geweben mittels Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Das Dechter Laboratory erforscht den Stickstoffmonoxid-Stoffwechsel. Stickstoffmonoxid stimuliert die zyklische GMP-Bildung durch eine adaptive Homöostase-Kaskade. Unser Ziel ist es, zu erfahren, wie sich Alterung, Ernährung und andere Faktoren auf diese Kaskade auswirken. Bisherige Forschungen konzentrierten sich auf die Bildung von Stickstoffmonoxid und die daraus resultierenden physiologischen Auswirkungen auf die Vernachlässigung der Kaskade, die beide verbindet. Unser Protokoll misst zyklisches GMP, einen zweiten Boten in der Kaskade. Unser Protokoll ist einfach, zugänglich und leicht an verschiedene Gewebetypen anpassbar.

[Erzähler] Um zu beginnen,

Legen Sie einen Taschentuchpulverisierer, eine Pinzette und einen Löffel 10 Minuten lang auf Trockeneis. Wiegen Sie einen Überschuss an Schweinegewebe ab, um den Verlust während der Pulverisierung auszugleichen. Übertragen Sie das Tuch in den gekühlten Pulverisierer, der auf Trockeneis liegt. Frosten Sie das Gewebe schockein, indem Sie flüssigen Stickstoff in den Pulverisierer gießen und ihn vollständig verdampfen lassen, bevor Sie fortfahren. Setzen Sie dann den Deckel des Pulverisierers wieder auf und schlagen Sie ihn 15 Mal mit einem Hammer an. Tarieren Sie nun ein Bead-Homogenisator-Rohr auf einer Waage. Übertragen Sie das pulverisierte Gewebe mit dem gekühlten Löffel und der Pinzette in das Röhrchen. Pipettieren Sie 0,1 normale Salzsäure in das Homogenisierungsröhrchen und stellen Sie sicher, dass das Volumen in Mikrolitern ein Vielfaches der Gewebemasse in Milligramm ist. Anschließend wird die Gewebeprobe mit einem Siebmühlen-Homogenisator homogenisiert. Zentrifugieren Sie das Homogenat 30 Minuten lang bei 17.000 g bei einer Probentemperatur von vier Grad Celsius. Den entstandenen Überstand in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Zentrifugieren Sie erneut 10 Minuten lang und halten Sie dabei eine Probentemperatur von vier Grad Celsius aufrecht. Ein Aliquot des endgültigen Überstands wird in ein Mikrozentrifugenröhrchen pipettiert und auf Eis gelegt. Pipettieren Sie anschließend 9,9 Milliliter ELISA-Puffer in ein Röhrchen mit der Bezeichnung Standard B. Pipettieren Sie 100 Mikroliter Standard-Stammlösung in das Standard-B-Röhrchen. Gründlich vortexen, um eine gleichmäßige Aufhängung zu gewährleisten. Übertragen Sie 1.000 Mikroliter der Lösung von Standard B in das Röhrchen mit der Bezeichnung Standard 1. Geben Sie dann 500 Mikroliter ELISA-Puffer in die Röhrchen mit der Bezeichnung Standard 0 und Standards 2 bis 8. Vortex-Standard 1. Übertragen Sie dann 500 Mikroliter der Lösung in Standard 2. Dann Standard 2 vortexen und 500 Mikroliter der Lösung in Standard 3 überführen. Übertragen Sie weiterhin 500 Mikroliter von jeder vorherigen Norm in die nächste und wirbeln Sie sie nach jeder Ausgabe gründlich durch, bis die Norm 8 vorbereitet ist. Für die Acetylierung der Proben werden 50 Mikroliter viermolares Kaliumhydroxid zu einem Aliquot von 250 Mikrolitern gegeben. Sofort 12,5 Mikroliter Essigsäureanhydrid hinzufügen. Wirbeln Sie die Lösung 15 Sekunden lang ein. Pipettieren Sie dann 12,5 Mikroliter vier molare Kaliumhydroxid und wirbeln Sie erneut. In das mit Standard 0 bezeichnete Röhrchen werden 100 Mikroliter Kaliumhydroxid mit vier Molen gegeben, unmittelbar gefolgt von 25 Mikrolitern Essigsäureanhydrid. Nach dem Vortexen 25 Mikroliter vier molare Kaliumhydroxid in das Röhrchen pipettieren und kurz vortexen. Wiederholen Sie die Zugabe von Kaliumhydroxid und Essigsäureanhydrid, gefolgt von Vortexen für die verbleibenden Standards. Geben Sie ein vorgegebenes Verhältnis von ELISA-Puffer und acetyliertem Probenaliquot in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Vortex Standard 0. Übertragen Sie 50 Mikroliter-Aliquots von Standard 0 in fünf Vertiefungen, die als NSB- und B-Null-Vertiefungen der ELISA-Mikroplatte bezeichnet werden. Geben Sie dann 50 Mikroliter ELISA-Puffer in die beiden NSB-Vertiefungen, die Standard 0 enthalten. Fügen Sie mit einer einzigen Pipettenspitze 50 Mikroliter-Aliquots der Standards 1 bis 8 in doppelte Vertiefungen hinzu, beginnend mit Standard 8 und weiter zu Standard 1. Jede Probe vortexen. Geben Sie dann 50 Mikroliter in doppelter oder dreifacher Ausführung in die entsprechenden Vertiefungen. Pipettieren Sie nun 50 Mikroliter Acetylcholinesterase-Tracer in alle Vertiefungen, die als NSB, B naught, standard und Probe gekennzeichnet sind. Geben Sie 50 Mikroliter Antiserum in jede Vertiefung B Null, jeden Standard und jede Probenvertiefung. Decken Sie die ELISA-Platte ab und inkubieren Sie sie 18 Stunden lang bei vier Grad Celsius. Nach der Inkubation drehen Sie die ELISA-Platte über einen Abfallbehälter, um den Inhalt zu entsorgen. Füllen Sie die Vertiefungen mit Waschpuffer mit einer Waschflasche. Fünf Sekunden lang vorsichtig rühren. Kippen Sie dann den Waschpuffer aus und klopfen Sie die restliche Flüssigkeit auf einem Papiertuch aus. Übertragen Sie nun das Ellman-Reagenz in ein Reservoir. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 200 Mikroliter des Ellman-Reagenzes in die Leer-, NSB-, B-Null-, TA-, Standard- und Probenvertiefungen zu geben. Geben Sie fünf Mikroliter Acetylcholinesterase-Tracer in die TA-Vertiefung. Decken Sie dann die ELISA-Platte mit Parafilm ab. Stellen Sie es in ein lichtgeschütztes Gefäß und inkubieren Sie es bei Raumtemperatur unter Rühren für 60 bis 90 Minuten. Entfernen Sie den Parafilm und lesen Sie die optische Dichte bei 412 Nanometern ab. Die zyklische GMP-Konzentration in der Schweineleber betrug in der Kontrollgruppe etwa 0,0202 Nanomol pro Gramm Gewebe. In der mit Nitrat behandelten Gruppe stieg die zyklische GMP-Konzentration auf etwa 0,0364 Nanomol pro Gramm Gewebe an.