Entwicklung eines innovativen LED-basierten Beleuchtungsgeräts für die in vitro Anwendung der photodynamischen Therapie mit Rose Bengal

Das Ziel unserer Forschung ist die Entwicklung grundlegender und translationaler Projekte, die darauf abzielen, die Wirkung der photodynamischen Therapie bei der Behandlung von Krebs ohne wirksame Therapieoptionen zu charakterisieren. Die aktuellen experimentellen Herausforderungen bestehen darin, die für die Umsetzung der photodynamischen Therapie notwendigen Technologien von der In-vitro-Anwendung bis zur klinischen Anwendung zu entwickeln, einschließlich neuer Photosensibilisatoren und neuer Beleuchtungsgeräte. Im Vergleich zu anderen Techniken handelt es sich bei unserem Protokoll um ein kostengünstiges und selbstgebautes Gerät, das eine großzügigere Beleuchtung einer 96-Well-Platte und des physiologischen Zustands in einem Zellkultur-Inkubator ermöglicht.

Nehmen Sie zunächst die kultivierten HepG2-Zellen aus dem Inkubator und stellen Sie den Kolben unter die vorgereinigte mikrobiologische Sicherheitsstation. Entfernen Sie das Nährmedium mit einer Pipette aus dem Kulturkolben. Um Medienreste zu entfernen, spülen Sie unter vorsichtigem Mischen mit phosphatgepufferter Lösung und entfernen Sie dann vorsichtig den Puffer.

Tragen Sie dann drei Milliliter Trypsinlösung mit 0,25 % Trypsin und 0,53 Millimolar EDTA auf die Zellen auf und stellen Sie die Kultur für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius wieder in den Inkubator, um die Zellen zu lösen. Nach fünf Minuten werden sieben Milliliter Kulturmedium in den Kolben gegeben, um das Trypsin zu neutralisieren und die Zellen zu suspendieren. Übertragen Sie nun das Trypsin, das Medium und die abgelösten Zellen in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Um die Zellen zu zählen, pipettieren Sie 20 Mikroliter der Zelllösung in ein sauberes Röhrchen und fügen Sie 20 Mikroliter Trypanblau-Lösung hinzu. Laden Sie nach dem Mischen die gefärbte Mischung auf den Zählobjektträger und setzen Sie sie in den Zellzähler ein. Geben Sie dann Kulturmedium in ein Röhrchen und führen Sie dann Zellen ein, um eine Endkonzentration von 150.000 Zellen pro Milliliter zu erreichen.

1,5 mal 10 hoch vier Zellen pro Well in eine weiße 96-Well-Platte mit klarem, flachem Boden aussäen. Bereiten Sie zwei Platten für jede Viabilitätsablesezeit vor. Inkubieren Sie die Platten vor der Behandlung 24 Stunden lang, damit sich die Zellen anheften können.

Um eine Stammlösung von Rose Bengal herzustellen, lösen Sie sie in 10% iger Kochsalzlösung auf. Verdünnen Sie die Behandlungslösungen für Rose Bengal in Konzentrationen von null bis 100 Mikromolar in Zellkulturmedium. Entfernen Sie nun das Kulturmedium von den Zellplatten und geben Sie 100 Mikroliter der vorbereiteten Behandlungslösungen für Bengalen in jede Vertiefung.

Inkubieren Sie die Zellen zwei Stunden lang mit Rosenbengalen, um die Internalisierung zu ermöglichen. Nach zwei Stunden nehmen Sie die Rosenbengallösung aus jeder Vertiefung, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, aspirieren Sie das PBS und fügen Sie 100 Mikroliter pro Vertiefung des Rosenbengalen-Freikulturmediums hinzu. Decken Sie die Mikrotiterplatten mit Aluminiumfolie ab, um sie vor Licht zu schützen, und legen Sie die Hälfte der Platten für die Beleuchtung während des photodynamischen Therapie-Assays beiseite.

Verbinden Sie den Stecker am Lichtverteiler mit der Buchse der Lichtquelle. Nehmen Sie die photodynamischen Therapie- und Dunkelhaut-Mikrotiterplatten aus dem Inkubator. Packen Sie die photodynamische Therapieplatte aus.

Stellen Sie dann den Dimmer am LED-Treiber auf den maximalen Pegel ein, um eine durchschnittliche Bestrahlungsstärke von 0,62 Milliwatt pro Quadratzentimeter über die 96 Vertiefungen zu liefern. Setzen Sie danach die Platte auf den Lichtverteiler. Beleuchten Sie die Mikroplatte, bis die gewünschte Lichtdosis auf die Zellen erreicht ist.

Sobald die gewünschte Lichtdosis erreicht ist, schalten Sie das Gerät aus. Wickeln Sie die Mikroplatte für photodynamische Therapie wieder in Aluminiumfolie ein und legen Sie sie zusammen mit der Kontrollplatte wieder in den Inkubator, bis der Viabilitätstest durchgeführt wird. Legen Sie die beleuchtete Platte nach Abschluss des photodynamischen Therapie-Assays für 24 Stunden in den Inkubator, um eine zelluläre Reaktion nach der Behandlung zu ermöglichen.

Nach der Inkubationszeit wird eine beleuchtete und eine unbeleuchtete Platte entnommen. Geben Sie 100 Mikroliter Reagenz aus dem Zellviabilitäts-Assay-Kit in jede Vertiefung, um den mitochondrialen Stoffwechsel und die ATP-Produktion zu messen. Inkubieren Sie die Platten 10 Minuten lang im Dunkeln, bevor Sie mit der Lumineszenzmessung fortfahren.

Nach 10 Minuten wird die Lumineszenz in jeder Vertiefung mit einem multimodalen Lesegerät abgelesen. Betrachten Sie die Lumineszenz aus den unbehandelten Kontrollwells als 100%ige Lebensfähigkeit. Normalisieren Sie die Lumineszenzwerte aus den behandelten Vertiefungen auf diese Kontrolle, um den Prozentsatz der Lebensfähigkeit für jede Behandlungsbedingung zu berechnen.

Wiederholen Sie das gleiche Protokoll für die Messung der Zellviabilität zu zusätzlichen Zeitpunkten nach der Behandlung, z. B. 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden. Die alleinige Beleuchtung ohne Rose Bengal veränderte die Lebensfähigkeit der HepG2-Zellen bei keiner der getesteten Lichtdosen, und Rose Bengal allein ohne Licht verursachte ebenfalls keine signifikante Veränderung über alle Konzentrationen hinweg. Die bengalische Therapie mit CELL-LED-550/3 reduzierte die Lebensfähigkeit der HepG2-Zellen bei allen Lichtdosen signifikant und zeigte eine starke zytotoxische Wirkung.

Die Überlappung zwischen dem LED-Emissionsprofil und dem Absorptionsspektrum von Rose Bengal bestätigte die spektrale Kompatibilität des CELL-LED-550/3 Bausteins mit dem Photosensibilisator. Eines unserer Hauptziele für die Zukunft ist es, neue PDT-Gehäuse zu entwickeln, die jeweils sowohl eine lichtempfindliche Substanz enthalten, die ein spezifisches Targeting von Krebszellen ermöglicht, als auch ein zugehöriges Beleuchtungsgerät.