Name: Modellierung einer persistierenden Pseudomonas aeruginosa-Infektion bei verwundeten Zebrafischlarven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Erfahren Sie die Modellierung persistierender Pseudomonas aeruginosa-Infektionen bei verwundeten Zebrafischlarven. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung chronischer Infektionen und beschleunigt die Entwicklung neuer antibakterieller Therapien.

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Alle in der vorliegenden Studie beschriebenen Zebrafischversuche wurden an der Universität Montpellier nach den 3R-Prinzipien (Replacement, Reduction and Refinement) gemäß den Leitlinien der Europäischen Union für den Umgang mit Versuchstieren durchgeführt und von der Direction Sanitaire et Vétérinaire de l'Hérault und dem Comité d'Ethique pour l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques unter der Referenz CEEA-LR-B4-172-37 genehmigt. Alle Infektionsexperimente wurden an Embryonen bis zu 5 Tage nach der Befruchtung durchgeführt. Die Zucht von adulten Zebrafischen (Danio rerio) aus den Fischen AB oder Golden Lines erfolgte nach den internationalen Richtlinien der EU-Tierschutzrichtlinie 2010/63/EU. Zebrafischanlage der Universität Montpellier mit Standardbedingungen wie einem 12 h:12 h Light: Dark Cycle, einem 3,5-Liter-Polycarbonat-Tank (maximal 22 Fische pro Tank), der an ein Umlaufsystem mit 4 % Salzgehalt/400 μS Leitfähigkeit und einer Wassertemperatur von 28 °C angeschlossen ist. Die Fische wurden 2x pro Tag mit Fischfutter gefüttert.
1. Herstellung von Lösungen
<ol>
	<li>Bereiten Sie eine 1x Arbeitslösung für Fischwasser mit oder ohne Methylenblau für die Züchtung von Zebrafischembryonen vor (siehe Tabelle 1).</li>
	<li>Bereiten Sie 20x Stamm (0,4%) und 1x funktionierende Tricain-Anästhesielösung vor, wie in Tabelle 1 beschrieben. Um ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Stammlösung zu vermeiden, 10 ml Aliquots von 20x Tricain vorbereiten und bei -20 °C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie 2%ige Triton-Lösung vor, verdünnt in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; Tabelle 1).</li>
</ol>
2. Herstellung eines Inokulums aus fluoreszierendem  P. aeruginosa , das GFP konstitutiv exprimiert
HINWEIS: Alle Arbeiten mit P. aeruginosa werden unter Beachtung von BSL-2-Vorsichtsmaßnahmen in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt. P. aeruginosa-Stämme sollten genetisch so verändert werden, dass sie konstitutiv einen fluoreszierenden Reporter exprimieren, wie z. B. GFP (wie hier verwendet und in13 beschrieben). Die Verwendung von Stämmen mit einem chromosomal kodierten Fluoreszenzreporter wird dringend empfohlen, um den Verlust von Plasmid im Falle eines Plasmidkodierten Fluoreszenzreporters zu vermeiden.
<ol>
	<li>2 Tage vor der Infektion wird bei -80 °C ein Bestand an genetisch veränderten P. aeruginosa , die GFP exprimieren, auf LB-Agarplatten ausgezogen (Tabelle 1) und über Nacht bei 37 °C inkubiert.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Fluoreszenz der Kolonien mit einem Fluoreszenzmikroskop (Vergrößerung 6x), um eine GFP+P. aeruginosa-Kolonie in 1 mL LB-Bouillon zu impfen (Tabelle 1) und wachsen Sie über Nacht bei 37 °C unter Schütteln (180 U/min).</li>
	<li>Am Tag der Infektion verdünnen Sie die obige Übernachtkultur von P. aeruginosa um 1:20 Uhr in 5 ml frische LB-Brühe. Züchten Sie die Bakterien bei 37 °C unter Schütteln (180 U/min), bis die Kultur einen OD600 = 0,8 erreicht. Dies sollte ca. 2-3 h dauern.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Bakterienkultur 10 min lang bei Raumtemperatur (RT) bei 3584 x g. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 4 mL Fischwasser ohne Methylenblau.</li>
	<li>Passen Sie das Kulturvolumen mit Fischwasser so an, dass es 7 x 107 bis 1 x 108 KBE/ml hat. Dies entspricht einem OD600 von ca. 0,15 (für jeden Stamm anzupassen).</li>
	<li>Um das Inokulum zu quantifizieren, führen Sie eine serielle Verdünnung der Bakteriensuspension durch, plattieren Sie 20 μl der 10-4-Verdünnung auf einer LB-Agarplatte und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C.</li>
	<li>Zählen Sie GFP+ -Kolonien unter einem Fluoreszenzmikroskop, um die KBE des Inokulums zu bestimmen.</li>
</ol>
3. Entnahme und Aufbereitung von Zebrafischembryonen
<ol>
	<li>3 Tage vor dem bakteriellen Immersionsexperiment Bilden Sie Zebrafisch-Brutpaare. Setze ein Zuchtmännchen und ein weibliches Zuchttier in ein Kreuzungsbecken.</li>
	<li>Am nächsten Morgen sammeln Sie die Eizellen nach der Befruchtung mit einem feinmaschigen Sieb. Legen Sie die gesammelten Eier in eine Petrischale, in der sich Fischwasser mit Methylenblau befindet.</li>
	<li>Um eine Kontamination zu vermeiden, geben Sie 1 Tropfen Bleichmittel in die Petrischale. Wechseln Sie nach 5 Minuten das Fischwasser durch Methylenblau, um das Bleiche zu entfernen.</li>
	<li>Eizellen mit abnormaler Embryonalentwicklung (unbefruchtete Eizellen ähneln einem 1-Zell-Eistadium) oder toten Eizellen (weißes Aussehen) entsorgen.</li>
	<li>Am Morgen der Infektion (bei 2 dpf) dechorionieren Sie die Embryonen mit zwei sehr dünnen Pinzetten unter dem Stereomikroskop (11-fache Vergrößerung). Reißen Sie das Chorion mit einer Pinzette ab, ohne den Embryo zu kneifen, um ihn freizusetzen.</li>
	<li>Legen Sie die dechorionierten Embryonen in eine Petrischale, in der sich Fische mit Methylenblau befinden. Inkubieren Sie die Schalen bei 28 °C bis zur Infektion.</li>
</ol>
4. Verletzung des Embryos
<ol>
	<li>Betäuben Sie Zebrafischembryonen in Fischwasser ohne Methylenblau, das 0,02 % Tricain enthält, ca. 5 min vor der Verletzung in einer Zellkulturschale (35 mm x 10 mm). Die Embryonen bewegen sich nicht mehr und reagieren nicht mehr auf Reize.</li>
	<li>Legen Sie 25G-Nadeln auf die Oberseite von zwei Essstäbchen, um die Handhabung der Nadeln zu erleichtern.</li>
	<li>Beseitigen Sie unter einem Stereomikroskop Embryonen mit abnormaler Entwicklung oder tote Embryonen. Sammeln Sie mit einer kreisenden Bewegung der Schale alle Embryonen in der Mitte.</li>
	<li>Isolieren Sie die Embryonen nacheinander mit zwei Nadeln in vertikaler Position (Kopf nach unten - Schwanz nach oben) und platzieren Sie die linke Nadel am Schwanz, um sie gerade zu halten. Schneide die Flosse am Rand des Notochords mit der rechten Nadel ein. Machen Sie den Schnitt in einem Zug. Überschreiten Sie nicht 10 Minuten zwischen dem Schneiden und dem Eintauchen in die Bakterienlösung.</li>
</ol>
5. Infektion verwundeter Embryonen
<ol>
	<li>Unter der biologischen Sicherheitswerkbank Typ II die P. aeruginosa-Lösung in einer Menge von ca. 1 x 107 KBE/ml vortexen und in eine 6-Well-Platte geben.</li>
	<li>Entnehmen Sie die verletzten Embryonen mit einer Einweg-Pasteur-Glaspipette und geben Sie sie in die Bakterienlösung unter dem mikrobiologischen Sicherheitsstift. Die Platte bei 28 °C 1,5 h inkubieren. HINWEIS: Wenn eine große Anzahl infizierter Larven benötigt wird, bilden Sie Gruppen von etwa 50 Larven, machen Sie die Wunde, tauchen Sie sie ein und wiederholen Sie den Vorgang für die folgende Gruppe.</li>
	<li>Waschen Sie die Embryonen nach der Infektion unter dem mikrobiologischen Sicherheitspfosten wie unten beschrieben.<ol>
		<li>Übertragen Sie die Embryonen mit einer Glaspipette zum Waschen in 10 ml Fischwasser ohne Methylenblau und fügen Sie so wenig Flüssigkeit wie möglich hinzu, für 30 Minuten bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Übertragen Sie die infizierten Embryonen erneut mit einer Glaspipette für eine zweite Wäsche für einige Minuten in 4 ml Fischwasser ohne Methylenblau.</li>
		<li>Übertragen Sie 24 infizierte Embryonen einzeln in eine Multi-Well-Platte mit 1 ml Fischwasser ohne Methylenblau.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Legen Sie die Platten in eine Kunststoffbox bei 28 °C in den Inkubator. Befeuchten Sie die Box (z. B. mit feuchten Papiertüchern), um die Verdunstung zu begrenzen.</li>
</ol>
6. Überleben infizierter Embryonen
<ol>
	<li>Bei Studien zum Überleben von Embryonen ist die Lebensfähigkeit unter einem Stereomikroskop 18 h, 24 h und 48 h nach der Infektion (hpi) zu überprüfen. Ein Embryo gilt als tot, wenn das Herz und die Blutzirkulation aufhören.</li>
	<li>Darstellen Sie die Sterblichkeits-/Überlebensraten mit Hilfe von Kaplan-Meier-Treppengrafiken (GraphPad Prism 8.3.0) und analysieren Sie die Daten mit einem Log-Rank oder anderen geeigneten statistischen Tests.</li>
</ol>
7. Zählung der bakteriellen Belastung in infizierten Embryonen (Abbildung 1)
<ol>
	<li>Führen Sie die KBE-Bestimmung von infizierten Embryonen zu vier verschiedenen Zeitpunkten durch: 1,5 hpi, d. h. direkt nach der Infektion, und nach jeder Wäsche bei 24, 48 und 72 hpi mit 5 Embryonen/Zeitpunkt. Führen Sie alle Schritte unter dem mikrobiologischen Sicherheitspfosten durch.</li>
	<li>Bereiten Sie für jede infizierte Larve 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 95 μl 1x PBS vor. Das Volumen der Larven beträgt etwa 5 μL.</li>
	<li>Übertragen Sie die Larven auf eine 6-Well-Platte mit 4 ml Fischwasser ohne Methylenblau, um eine Wäsche durchzuführen und Planktonbakterien zu beseitigen.</li>
	<li>Legen Sie jeden Embryo in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das PBS enthält, und fügen Sie so wenig Flüssigkeit wie möglich hinzu. Berühren Sie einfach die Glaspipette mit den Larven auf der Oberfläche des PBS, damit die Larven ohne Zugabe von Flüssigkeit in das Mikrozentrifugenröhrchen einsinken können.</li>
	<li>Zerkleinern Sie die Embryonen einzeln mit einem Stößel an der Seite des Mikrozentrifugenröhrchens. Bewahren Sie den Stößel in der Tube auf. Bestimmen Sie den Endpunkt, wenn kein intakter Embryo mehr vorhanden ist.</li>
	<li>Heben Sie den Stößel an und fügen Sie 100 μl PBS-Triton 2 % hinzu, um alle verbleibenden Bakterien aus dem Stößel zu spülen (die Endkonzentration beträgt 1 %). Vortex und 10 min warten. Verarbeiten Sie nicht mehr als fünf Embryonen gleichzeitig.</li>
	<li>Für jeden Embryo werden 3x 10 μl unverdünnte Lysate auf LB-Agarplatten getropft. Führen Sie mit einer Mehrkanalpipette eine serielle Verdünnung der Lysate in einer 96-Well-Platte durch, bis eine 10:3-Verdünnung erreicht ist. 3x 10 μl Verdünnung 10-1, 10-2 und 10-3 neben die unverdünnten Verdünnungen auf LB-Agarplatten geben und die Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren.</li>
	<li>Zählen Sie die fluoreszierenden Kolonien jeder Verdünnung unter dem Mikroskop und berechnen Sie die KBE pro infiziertem Embryo.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68464/68464fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Experimenteller Zeitplan zur Beurteilung der bakteriellen Virulenz und Persistenz im Zebrafischembryo. Abkürzungen: CFU = Koloniebildende Einheiten, hpi = Stunden nach der Infektion. Die Zeichnung wurde mit BioRender.com erstellt. Die Zahl wurde von13 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68464/68464fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
8. Erprobung der Behandlung gegen persistierende Infektionen (Abbildung 2)
<ol>
	<li>Bereiten Sie Antibiotikalösungen mit dem 40-fachen der minimalen Hemmkonzentration (MIC) für den Stamm P. aeruginosa vor. Überprüfen Sie vor dem Versuch, ob die gewählte Konzentration des Antibiotikums für den Embryo nicht toxisch ist.</li>
	<li>Führen Sie die Schritte 7.1 und 7.2 aus. Geben Sie 1 ml Fischwasser mit Antibiotika in eine 24-Well-Platte und führen Sie eine Kontrolle ohne Antibiotika durch.</li>
	<li>Übertragen Sie fünf Embryonen pro Behandlung aus dem Waschschritt in die 24-Well-Platte und fügen Sie so wenig Flüssigkeit wie möglich hinzu.</li>
	<li>Mit den Antibiotika 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. Kehren Sie zu Schritt 7.3 zurück. zur Quantifizierung der bakteriellen Belastung nach der Behandlung.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68464/68464fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Experimentelles Verfahren zur Beurteilung der Wirksamkeit von Antibiotikabehandlungen bei infizierten Embryonen. Abkürzungen: ATB 30' = Antibiotikabehandlung für 30 min, KBE = Koloniebildende Einheiten, hpi = Stunden nach der Infektion. Die Zeichnung wurde mit BioRender.com erstellt. Die Zahl wurde von13 geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68464/68464fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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</ol>

<a href="https://app.jove.com/t/6639">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/68464">10.3791/68464</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/68464">Modeling Persistent Pseudomonas aeruginosa Infection in Wounded Zebrafish Larvae</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.

Erratum: Modeling Persistent Pseudomonas aeruginosa Infection in Wounded Zebrafish Larvae

<table><tbody><tr><td>Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonat</td><td>Sigma</td><td>Nr. E50521</td><td></td></tr><tr><td>Kolben-Pellet</td><td>Eppendorf, Dutscher</td><td>33522</td><td></td></tr><tr><td>Meersalz</td><td>Instant Ocean, Aquariensysteme&nbsp; &nbsp;</td><td>218035</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Euromedex</td><td>2000-B</td><td></td></tr></tbody></table>

modellierung einer persistierenden pseudomonas aeruginosa-infektion bei verwundeten zebrafischlarven

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Entschlüsselung und Imaging Pathogenese und Cording von<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; In Zebrafischembryonen

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Die vorliegende Studie beschreibt ein Zebrafish Embryos Modell zur in-vivo Visualisierung und intravitalen Analyse von Biomaterial-assoziierten Infektionen im Laufe der Zeit anhand der Fluoreszenz-Mikroskopie. Dieses Modell ist ein viel versprechende Ergänzung Säugetier-Tiermodellen wie Maus-Modellen für das Studium Biomaterial-Infektionen in-vivo.

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Wir beschreiben ein verzögertes Impfprotokoll zur Erzeugung chronischer Wundinfektionen bei immunkompetenten Mäusen.

Ein verzögertes Impfmodell der chronischen Pseudomonas aeruginosa Wundinfektion

Dieses Protokoll beschreibt ein Aspergillus-Infektionsmodell bei Zebrafischlarven. Aspergillus Sporen werden mikroinjiziert in das Hinterhirn von Larven, und chemische Behandlung wird verwendet, um Immunsuppression zu induzieren. Das Fortschreiten der Infektion wird über eine tägliche Bildgebung überwacht, um das Pilzwachstum und die Immunantworten sowie die Aufzählung lebender Sporen durch Koloniebildbildung zu überwachen.

Infektion von Zebrafischlarven mit Aspergillus Sporen zur Analyse von Wirts-Pathogen-Wechselwirkungen

Erfahren Sie die Modellierung persistierender Pseudomonas aeruginosa-Infektionen bei verwundeten Zebrafischlarven. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung chronischer Infektionen und beschleunigt die Entwicklung neuer antibakterieller Therapien.

Modellierung einer persistierenden Pseudomonas aeruginosa-Infektion bei verwundeten Zebrafischlarven

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