Modellierung einer persistierenden Pseudomonas aeruginosa-Infektion bei verwundeten Zebrafischlarven

Chronische Infektionen, die durch das Bakterium Pseudomonas aeruginosa verursacht werden, sind tolerant gegenüber Antibiotika und sehr schwer zu behandeln. Unser Ziel ist es, ein In-vivo-Modell zu entwickeln, das die Entdeckung effizienter Therapien beschleunigt. Antibakterielle Medikamente werden meist in vitro gescreent, und die Erprobung von Medikamenten an chronisch infizierten Mäusen ist eine komplexe Herausforderung. Um die Lücke zwischen diesen beiden Ansätzen zu schließen, schlagen wir ein alternatives präklinisches Modell mit verwundeten Zebrafischlarven vor. Unser Modell der persistenten Infektion im Zebrafisch, das auf der Verwendung eines klinischen Stammes von Pseudomonas aeruginosa basiert, reproduziert die Antibiotikatoleranz. Während die Mikroinjektion häufig zur Infektion von Zebrafischlarven eingesetzt wird, spiegelt unsere Verwundungsmethode einen natürlichen Infektionsmodus wider und eignet sich gut für das Screening von therapeutischen Wirkstoffen.

[Erzähler] Legen Sie zunächst 25-Gauge-Nadeln auf zwei Essstäbchen, um die Handhabung zu erleichtern. Identifizieren und entfernen Sie mit einem Stereomikroskop Embryonen, die eine abnormale Entwicklung aufweisen oder nicht lebensfähig sind. Bewegen Sie die Schale in kreisenden Bewegungen, um die restlichen Embryonen in der Mitte zu sammeln. Verwenden Sie nun zwei vertikal ausgerichtete Nadeln, um jeden Embryo zu isolieren, und positionieren Sie die linke Nadel am Schwanz, um den Körper gerade zu halten. Machen Sie mit der rechten Nadel einen einzigen Schnitt am Rand des Notochords, um die Flosse zu entfernen. Führen Sie jeden Schnitt schnell durch und stellen Sie sicher, dass alle Embryonen innerhalb von 10 Minuten in bakterielle Lösung getaucht werden. Für das Infektionsverfahren wird die Pseudomonas aeruginosa-Lösung unter einer biologischen Sicherheitswerkbank vom Typ zwei vortexen und in einer Dosis von etwa eins mal 10 hoch sieben koloniebildenden Einheiten pro Milliliter auf eine Sechs-Well-Platte gegeben. Verwenden Sie eine Einweg-Pasteurpipette aus Glas, um die verwundeten Embryonen zu sammeln und in die Bakterienlösung zu übertragen. Inkubieren Sie die Sechs-Well-Platte 1,5 Stunden lang bei 28 Grad Celsius. Entnehmen Sie nach der Inkubation die infizierten Embryonen und legen Sie sie zum Waschen unter die mikrobiologische Sicherheit. Übertragen Sie nun die Embryonen mit einer Glaspipette in 10 Milliliter Fischwasser ohne Methylenblau, minimieren Sie das übertragene Volumen und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Dann werden die Embryonen wieder mit einer Glaspipette in vier Milliliter Fischwasser ohne Methylenblau übertragen und kurz inkubiert. Übertragen Sie anschließend die infizierten Embryonen mit einer Pipette einzeln in eine 24-Well-Platte und geben Sie einen Milliliter Fischwasser ohne Methylenblau in jede Well. Stellen Sie die 24-Well-Platte in einen auf 28 Grad Celsius eingestellten Inkubator. Bereiten Sie 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 95 Mikrolitern 1X PBS für jede infizierte Larve vor. Setzen Sie die Larven in eine Sechs-Well-Platte mit vier Millilitern Fischwasser ohne Methylenblau um, um die Planktonbakterien zu waschen und zu entfernen. Legen Sie jeden gewaschenen Embryo in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit PBS und übertragen Sie so wenig Flüssigkeit wie möglich. Drücke nun jeden Embryo mit einem Stößel gegen die Seite des Mikrozentrifugenröhrchens und lasse den Stößel anschließend im Röhrchen. Heben Sie dann den Stößel an und fügen Sie 100 Mikroliter 2% PBS Triton hinzu, um die Restbakterien aus dem Stößel zu spülen und eine Endkonzentration von 1% zu erreichen. Den Schlauch verwirbeln und 10 Minuten inkubieren. Geben Sie als Nächstes drei 10-Mikroliter-Tropfen unverdünntes Lysat von jedem Embryo auf LB-Agarplatten. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um jedes Lysat in einer 96-Well-Platte seriell bis zu 10 hoch zu verdünnen, hoch minus drei Verdünnung. Zum Schluss geben Sie drei 10-Mikroliter-Tropfen der Verdünnungen neben die unverdünnten Flecken. Und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Alle vier Mukoviszidose-Pseudomonas aeruginosa-Isolate waren im verletzten Embryomodell im Vergleich zum PAO1-Referenzstamm signifikant weniger virulent. Bei Embryonen, die mit zwei Isolaten infiziert waren, war die Bakterienlast über drei Tage deutlich reduziert, was auf eine bakterielle Eliminierung hindeutet. Im Gegensatz dazu behielten die beiden anderen Isolate, B6513 und RP73, nach einem anfänglichen Abfall von 18 bis 65 Stunden nach der Infektion eine relativ stabile Bakterienlast bei, was auf eine Persistenz hindeutet. Eine kurze 30-minütige Behandlung mit Tobramycin 1,5 Stunden nach der Infektion reduzierte die Bakterienlast bei Embryonen, die mit den Isolaten B6513 infiziert waren, drastisch. Tobramycin hatte keinen signifikanten Einfluss auf die bakterielle Belastung, wenn es 24 oder 48 Stunden nach der Infektion verabreicht wurde, was eine Resistenz in persistierenden Infektionsstadien zeigte.