Name: Ookluc: Eine Plasmodium berghei-Linie zur Identifizierung von transmissionsblockierenden Verbindungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Erfahren Sie eine Hochdurchsatz-Methode zur Identifizierung von transmissionsblockierenden Verbindungen in Plasmodium berghei. Dieses Protokoll ermöglicht präzise IC50-Bestimmung und unterstützt Strategien zur Unterbrechung der Malaria-Übertragung.

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Alle Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit ethischen Richtlinien durchgeführt und von der Ethikkommission für die Verwendung von Tieren des Instituts für Biomedizinische Wissenschaften der Universität São Paulo (CEUA-ICB/USP) genehmigt. Die Tiere wurden in Übereinstimmung mit den von diesem Ausschuss festgelegten Standards untergebracht und gehalten. Die Experimente mit genetisch veränderten Plasmodium-Parasiten sowie deren kryokonservierte Lagerung bei -80 °C wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften des Institutionellen Ausschusses für biologische Sicherheit des Instituts für Biomedizinische Wissenschaften der Universität São Paulo (CIBio-ICB/USP) durchgeführt. In dieser Studie wurden insgesamt drei weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 3-5 Wochen verwendet - zwei infizierte und eine nicht infizierte.
1. Materialien und Reagenzien
<ol>
	<li>Bereiten Sie das Ookinetmedium vor, indem Sie RPMI 1640 mit 0,025 M HEPES, Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN), 50 mg/l Hypoxanthin und 100 μM Xanthurensäure ergänzen. Stellen Sie den pH-Wert auf 8,3 8,16 ein.</li>
	<li>Bereiten Sie die Arbeitslösung für den Lumineszenz-Assay vor, indem Sie 1 Volumen des Substrats mit 50 Volumen des im Luciferase-Assay-System bereitgestellten Lysepuffers mischen.</li>
	<li>Stellen Sie einen Inkubator auf 21 °C ein.</li>
</ol>
2. Infektion und parasitierte Blutentnahme
<ol>
	<li>Infizieren Sie zwei weibliche BALB/c-Mäuse (4-6 Wochen alt) mit 150 μl kryokonserviertem Ookluc-Stamm durch intraperitoneale (IP) Injektion (Tag 0). HINWEIS: In diesem Protokoll empfehlen wir die Verwendung von BALB/c-Mäusen aufgrund ihrer leichten Verfügbarkeit und ihrer weit verbreiteten Verwendung in Tierhaltungen. Jeder Wildtyp-Mausstamm, der anfällig für eine P. berghei-Infektion ist und die Gametozytogenese unterstützt, sollte jedoch für den Einsatz geeignet sein.</li>
	<li>Ab Tag 3 ist die Parasitämie und Gametozytämie durch mikroskopische Untersuchung von Giemsa-gefärbten Blutausstrichen zu beurteilen.</li>
	<li>Wenn Parasitämie und Gametozytämie etwa 5 % bzw. 0,5 % erreichen (normalerweise an Tag 4), entnehmen Sie Blut durch Herzpunktion mit heparinisierten Spritzen und sammeln Sie das Blut von beiden infizierten Mäusen. HINWEIS: Obwohl es sich um eine transgene Linie von P. berghei handelt, ähneln ihr Wachstum und ihr Gametozytämieprofil denen, die beim ANKA-Stamm beobachtet wurden. In diesem Zusammenhang ist der Anteil der Gametozyten im Verhältnis zur Gesamtparasitämie etwa 10x geringer. HINWEIS: Idealerweise wird die Verbundplatte (siehe unten) vor der Entnahme von parasitiertem Blut vorbereitet, so dass das Blut sofort nach der Entnahme auf die Platte pipettiert wird. Wenn das Mausblut in einem anderen Raum entnommen werden muss oder aus anderen Gründen nicht sofort auf die Verbundplatte pipettiert werden kann, muss das entnommene Blut nicht länger als 30 Minuten bei 37 °C aufbewahrt werden.</li>
</ol>
3. Conversion Assay - Screening in 96-Well-Platten
HINWEIS: Um konsistente Ergebnisse zu gewährleisten, sollte der gesamte Versuch dreimal an verschiedenen Tagen wiederholt werden, um die Ergebnisse zu bestätigen.
<ol>
	<li>Bereiten Sie die Verbindungsproben mit Ookinetmedium als Verdünnungsmittel vor (eine Endkonzentration von 10 μM). Verdünnen Sie das Verbundmaterial auf 1 mM und bereiten Sie Arbeitsproben vor, indem Sie das 1 mM-Material 1:100 v:v in Ookinete Medium verdünnen. Bereiten Sie für einen Assay in doppelter Ausführung ein Endvolumen von 200 μl der Arbeitsprobe vor.</li>
	<li>Wird die Verbindung in einem anderen Lösungsmittel als Wasser verdünnt, so ist eine Kontrollprobe hinzuzufügen, die das in Ookinetmedium verdünnte Lösungsmittel im gleichen Verhältnis wie in der Prüfprobe enthält, um sicherzustellen, dass die beobachtete Hemmung auf die Verbindung und nicht auf das Lösungsmittel zurückzuführen ist. HINWEIS: Als Beispiel werden wir 90 Verbindungen untersuchen.</li>
	<li>Platzieren Sie unter Verwendung von zwei 96-Well-Platten 80 μl der Proben in jeder Vertiefung, wie folgt und in Abbildung 1 dargestellt, in doppelter Ausführung (zwei Platten): Positivkontrolle: 80 μl Ookinetmedium; Negativkontrolle: 80 μl Ookinetmedium; Lösungsmittelkontrolle: 80 μl Ookinetmedium mit 1 % DMSO; Proben: 80 μl von 10 μM jeder Verbindung in Ookinetmedium.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Schematische Darstellung eines 96-Well-Plattenlayouts, das für das Screening von Verbindungen ausgelegt ist. Das Plattenlayout umfasst eine Positivkontrolle (C+), eine Negativkontrolle (C-), eine Kontrolle plus Verdünnungslösungsmittel (C+S) und 90 Testverbindungen (S1-S90). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="4">
	<li>4 μl parasitiertes Mausblut werden in jede Vertiefung der 96-Well-Platte im Verhältnis 1:20 v:v gegeben, außer zur Negativkontrolle (C-). Schonend durch Pipettieren homogenisieren. HINWEIS: Unter Berücksichtigung der Verluste berechnen wir den Bedarf von ~400 μL parasitiertem Blut für jede Platte.</li>
	<li>Für die Negativkontrolle fügen Sie nicht infiziertes Mausblut im Verhältnis 1:20 hinzu (v:v, Blut:Probe). Schonend homogenisieren.</li>
	<li>Bei 21 °C für 6 h oder 24 h inkubieren. HINWEIS: Die nLuc-Aktivität ist nach 6 Stunden Inkubation nachweisbar und erreicht nach 24 Stunden des Assaysihren Höhepunkt 8. Der Assay ist nicht in der Lage, Verbindungen mit Aktivität nach der Zygotenbildung zu identifizieren, wie z. B. Verbindungen, die die Ookineten-Morphogenese hemmen, da gebildete Zygoten nLuc unabhängig von der abgeschlossenen Morphogenese akkumulieren. Daher ist eine 6-stündige Inkubation ausreichend, um alle Verbindungen nachzuweisen, die die nLuc-Aktivität blockieren, indem sie die Gametogenese oder die sexuelle Rekombination hemmen oder eine frühe Zytotoxizität aufweisen. Normalerweise bevorzugen wir jedoch Inkubationen von 24 Stunden, um stärkere Signale und ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten.</li>
</ol>
4. Lumineszenz-Assay
<ol>
	<li>Nach der Inkubationszeit werden die Proben durch Auf- und Abpipettieren homogenisiert, um eine gründliche Durchmischung des Blut-Mediums zu gewährleisten.</li>
	<li>Bereiten Sie die Mischung aus Lysepuffer und Luciferase-Substrat unmittelbar vor der Verwendung im Verhältnis 1:50 vor (v:v, Substrat:Lysepuffer).</li>
	<li>Mischen Sie die Substratmischung mit den Proben im Verhältnis 1:1 (v:v) und achten Sie dabei auf ein schonendes Mischen, um Blasen zu vermeiden. Bei 37 °C 3-5 min inkubieren. HINWEIS: In diesem Beispiel haben wir 84 μl Substrat-Lyse-Puffer zu jeder Vertiefung hinzugefügt.</li>
	<li>Übertragen Sie die Proben auf eine weiße 96-Well-Platte mit flachem Boden. Messen Sie die Lumineszenz mit einem Plattenlesegerät. Verwenden Sie die folgende Parameterkonfiguration: Emissionsfilter: Objektiv; Messintervallzeit: 1 s pro Well.</li>
</ol>
5. Datenanalyse - Screening
<ol>
	<li>Notieren Sie sich nach dem Lumineszenz-Assay die Rohdaten, die angezeigt werden (Abbildung 2). HINWEIS: Die erhaltenen relativen Lichteinheiten (RLU) hängen vom verwendeten Luminometer ab. In unserem Fall lagen die RLU-Werte für die Positivkontrolle zwischen 10.000 und 500.000 in einem 24-Stunden-Inkubationsassay. Kürzere Inkubationszeiten (6 h) führen zu niedrigeren RLU-Werten.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig2.jpg"> 
Abbildung 2: Ergebnisse einer simulierten Messung eines Umwandlungsassays für das Screening von Verbindungen. Das Bild zeigt simulierte Lumineszenzmesswerte aus einem Assay, der nach der Umwandlung von Ookineten in Gegenwart eines Panels von 90 Verbindungen durchgeführt wurde. Niedrigere Werte für die relative Lichteinheit weisen auf eine verringerte Ookinetenbildung hin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="2">
	<li>Berechnen Sie anhand einer Tabelle den Mittelwert jeder Messung mit der folgenden Formel. Ersetzen Sie XX durch die Adresse der ersten Messzelle und YY durch die Adresse der zweiten Messzelle. Wiederholen Sie die Formel für alle Proben. =(DURCHSCHNITT(XX:YY)</li>
	<li>Wandeln Sie die Daten in % Inhibition um, um die Ergebnisse besser analysieren zu können. Verwenden Sie in der Tabelle die folgende Formel. Ersetzen Sie A durch den RLU-Wert der Stichprobe und B durch den RLU-Wert der Kontrolle. Wiederholen Sie die Formel für alle getesteten Verbindungen: = 1 - (A/B) x 100 HINWEIS: Die Daten werden wie in Abbildung 3 dargestellt angezeigt.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Ergebnisse aus einer simulierten Messung eines Umwandlungsassays für das Screening von Verbindungen, dargestellt in % der Hemmung für jede Verbindung. Prozentsatz der Umwandlungshemmung für jede getestete Verbindung, berechnet wie oben beschrieben. Die hervorgehobenen Quadrate weisen auf Verbindungen hin, die eine Umwandlungshemmung von mehr als 95 % fördern. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="4">
	<li>Identifizieren Sie die Verbindungen, die eine Hemmung von mehr als 95 % aufweisen. HINWEIS: Diese Verbindungen zeigen eine hohe Aktivität gegen sexuelle Stadien bei einer Konzentration von 10 μM. In unserem Beispiel haben wir fünf Verbindungen mit hoher Aktivität gegen sexuelle Stadien gefunden.</li>
	<li>Für die identifizierten Verbindungen ist eine IC50-Bestimmung wie unten beschrieben durchzuführen.</li>
</ol>
6. Conversion Assay - Bestimmung von IC 50
<ol>
	<li>Infizieren Sie Mäuse mit Ookluc und sammeln Sie parasitiertes Blut, wie in Abschnitt 2 beschrieben.</li>
	<li>Bereiten Sie die Proben mit Ookinetmedium als Verdünnungsmittel vor. Es ist eine Anfangskonzentration zu verwenden, bei der eine 100%ige Hemmung der Umwandlung durch die Verbindung beobachtet wird. HINWEIS: Da die Wirkstoffe in einem Screening mit einer Konzentration von 10 μM identifiziert wurden, verwenden wir 20 μM als Anfangskonzentration für die erste Dosis-Wirkungs-Kurve. Für eine genaue Dosis-Wirkungs-Kurve ist es wichtig, dass Ihr Assay Anfangskonzentrationen enthält, die zu einer 100%igen Hemmung der Umwandlung führen, und Endkonzentrationen, die zu einer Hemmung von 0 % führen. Dieser Ansatz gewährleistet eine präzise IC50-Berechnung . Die erste Dosis-Wirkungs-Kurve gibt Aufschluss über die niedrigsten Konzentrationen der Verbindung mit ~100% Hemmung. In diesem Protokoll verwenden wir als Beispiel PyAz90, das kürzlich mit Ookluc13 identifiziert wurde.</li>
	<li>In einer 96-Well-Platte dreifach zugeben (siehe Abbildung 4): Positivkontrolle (C+): 80 μl Ookinetmedium; Negativkontrolle (C-): 80 μl Ookinetmedium; Erste Verdünnung der Probe (Cpd D1): 160 μl der Verbindung bei einer Anfangskonzentration im Ookinetmedium, die zu einer 100%igen Hemmung der Umwandlung führt; Vertiefungen D2 bis D12: 80 μl Ookinetmedium.</li>
	<li>Führen Sie zweifache serielle Verdünnungen durch, indem Sie 80 μl Vertiefung D1 in D2 pipettieren, homogenisieren und 80 μl Vertiefung D2 in D3 pipettieren und so weiter. Stellen Sie sicher, dass alle Vertiefungen ein Gesamtvolumen von 80 μl haben, also entsorgen Sie die letzten 80 μl, die aus der Vertiefung D12 entnommen wurden. HINWEIS: Führen Sie das Experiment mit mindestens drei Wiederholungen für alle Stichproben durch, wie in Abbildung 4 dargestellt. Um die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit Ihrer Ergebnisse zu gewährleisten, sollte das gesamte Experiment an drei verschiedenen Tagen mit jeweils neu infizierten Tieren wiederholt werden. HINWEIS: Wenn die Ergebnisse im ersten Screening keinen Einfluss des Lösungsmittels auf die Umwandlung zeigen, ist es nicht erforderlich, diese Kontrollen in serielle Verdünnungen einzubeziehen. Andernfalls müssen auch serielle Verdünnungen des Lösungsmittels einbezogen werden.</li>
</ol>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig4.jpg"> 
Abbildung 4: 96-Well-Plattenlayout, das für die Bestimmung von Compound IC50 ausgelegt ist. Das Plattenlayout umfasst Verdünnungen der Positivkontrolle (C+), der Negativkontrolle (C-) und der Verbindung (Cpd) (D1 bis D12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="5">
	<li>Geben Sie parasitiertes Mausblut in die 96-Well-Platte bei einem Verhältnis von 1:20 v:v. Schonend durch Pipettieren homogenisieren. HINWEIS: In jede Vertiefung werden insgesamt 4 μl parasitiertes Blut gegeben, außer in die Negativkontrolle (C-). Unter Berücksichtigung der Verluste berechnen wir den Bedarf von ~200 μL parasitiertem Blut für jede zu testende Verbindung.</li>
	<li>In Negativkontrollvertiefungen wird nicht infiziertes Mausblut im Verhältnis 1:20 (v:v, Blut:Probe) zugegeben. Schonend homogenisieren.</li>
	<li>Bei 21 °C für 6 h oder 24 h inkubieren.</li>
	<li>Führen Sie den Lumineszenz-Assay durch, wie in Abschnitt 4 beschrieben.</li>
</ol>
7. Datenanalyse - IC 50 Bestimmung
HINWEIS: IC50 ist definiert als die Konzentration einer Verbindung, die erforderlich ist, um 50 % der biologischen Aktivität/Hemmung zu hemmen. In diesem Assay bezieht sich die Hemmung auf die Verringerung der Ookinetumwandlung. Die Daten werden als sigmoidale Dosis-Wirkungs-Kurve dargestellt, wobei die X-Achse die Verbindungskonzentration (logarithmisch transformiert) und die Y-Achse die prozentuale Hemmung darstellt.
<ol>
	<li>Die prozentuale Hemmung wird wie in Abschnitt 5, Schritt 5.3 beschrieben berechnet.</li>
	<li>Öffnen Sie die Software und erstellen Sie eine XY-Tabelle.</li>
	<li>Legen Sie die Optionen für die Y-Achse auf Geben Sie 3 Replikationswerte in nebeneinander liegenden Unterspalten ein.</li>
	<li>Pastendaten, wobei X für die Verbindungskonzentration und Y für die prozentuale Hemmung steht (Abbildung 5A).</li>
	<li>Klicken Sie in der Menüleiste auf Analysieren und wählen Sie Nichtlineare Regression (Kurvenanpassung) und dann Dosis-Wirkungs-Kurven - Hemmung und [Inhibitor] vs. normalisierte Reaktion -- variable Steigung; klicken Sie auf OK.</li>
	<li>Beobachten Sie im linken Bereich die Dosis-Wirkungs-Kurve der Daten. Wenden Sie die gewünschte Personalisierung an, z. B. Farbänderungen und Punktformate.</li>
	<li>Suchen Sie die Nonlin-Fit-Tabelle, um das berechnete IC50 und das 95 %-Konfidenzintervall (95 %-KI) zu ermitteln (Abbildung 5B).</li>
</ol>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig5.jpg"> 
Abbildung 5: Dosis-Wirkungs-Kurve von PyAz90. Die %-Hemmung wurde in Abhängigkeit von der PyAz90-Konzentration (μM) auf einer logarithmischen Skala gemessen. Die sigmoidale Kurve stellt die angepassten Daten dar, die zur Bestimmung des IC50 verwendet wurden, der 0,013 μM betrug (95 % Konfidenzintervall: 0,012-0,014 μM). Datenpunkte stellen den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts aus experimentellen Replikationen dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<ol><li>World malaria report 2024: addressing inequity in the global malaria response. , World Health Organization. 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2024">https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2024</a> (2025).</li>
<li>Miller, L. H., Ackerman, H. C., Su, X., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+biology+and+disease+pathogenesis%3A+insights+for+new+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">Malaria biology and disease pathogenesis: insights for new treatments.</a> Nature Med. 19 (2), 156-167 (2013).</li>
<li>Tsoumani, M. E., Voyiatzaki, C., Efstathiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+Vaccines%3A+From+the+Past+towards+the+mRNA+Vaccine+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Malaria Vaccines: From the Past towards the mRNA Vaccine Era.</a> Vaccines. 11 (9), 1452(2023).</li>
<li>Ménard, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+under+the+skin%3A+the+first+steps+in+malarial+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Looking under the skin: the first steps in malarial infection and immunity.</a> Nature Rev. Microbiol. 11 (10), 701-712 (2013).</li>
<li>Appetecchia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission-blocking+strategies+for+malaria+eradication%3A+Recent+advances+in+small-molecule+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Transmission-blocking strategies for malaria eradication: Recent advances in small-molecule drug development.</a> Pharmaceuticals. 17 (7), 962(2024).</li>
<li>Baniecki, M. L., Wirth, D. F., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+Plasmodium+falciparum+growth+assay+for+malaria+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput Plasmodium falciparum growth assay for malaria drug discovery.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (2), 716-723 (2007).</li>
<li>Delves, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activities+of+current+antimalarial+drugs+on+the+life+cycle+stages+of+Plasmodium%3A+A+comparative+study+with+human+and+rodent+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">The activities of current antimalarial drugs on the life cycle stages of Plasmodium: A comparative study with human and rodent parasites.</a> PLoS Med. 9 (2), e1001169(2012).</li>
<li>Calit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+the+pathogen+box+for+molecules+active+against+Plasmodium+sexual+stages+using+a+new+nanoluciferase-based+transgenic+line+of+P.+berghei+identifies+transmission-blocking+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Screening the pathogen box for molecules active against Plasmodium sexual stages using a new nanoluciferase-based transgenic line of P. berghei identifies transmission-blocking compounds.</a> Antimicrob Agents Chemother. 62 (11), e01053-e01118 (2018).</li>
<li>Calit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+transmission-blocking+antimalarials+identified+by+high-throughput+screening+of+Plasmodium+berghei+Ookluc%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Novel transmission-blocking antimalarials identified by high-throughput screening of Plasmodium berghei Ookluc.</a> Antimicrob Agents Chemother. 67 (4), e0146522(2023).</li>
<li>Lima, M. N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+multi-kinase+approach+for+the+identification+of+potent+antiplasmodial+hits%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Chem%22%5BJournal%5D)">Integrative multi-kinase approach for the identification of potent antiplasmodial hits.</a> Front Chem. 7, 773(2019).</li>
<li>Ferreira, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+chemogenomics+drug+repositioning+strategy+enables+the+discovery+of+epirubicin+as+a+new+repurposed+hit+for+Plasmodium+falciparum%C3%82%C2%A0and%C3%82%C2%A0P.+vivax%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Computational chemogenomics drug repositioning strategy enables the discovery of epirubicin as a new repurposed hit for Plasmodium falciparumÂ andÂ P. vivax.</a> Antimicrob Agents Chemother. 64 (9), aac.02041-aac.02119 (2020).</li>
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<li>Lima, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chalcones+as+a+basis+for+computer-aided+drug+design%3A+Innovative+approaches+to+tackle+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Chalcones as a basis for computer-aided drug design: Innovative approaches to tackle malaria.</a> Future Med Chem. 11 (20), 2635-2646 (2019).</li>
<li>Ferreira, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+4-aminoquinoline+chemotype+with+multistage+antimalarial+activity+and+lack+of+cross-resistance+with+PfCRT+and+PfMDR1+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A novel 4-aminoquinoline chemotype with multistage antimalarial activity and lack of cross-resistance with PfCRT and PfMDR1 mutants.</a> PLoS Pathog. 20 (10), e1012627(2024).</li>
<li>Blagborough, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+transmission+blockade+in+Plasmodium+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing transmission blockade in Plasmodium spp.</a> Methods Mol Biol. 923, 577-600 (2013).</li>
<li>Azevedo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+method+for+in+vitro+screening+of+Plasmodium+transmission-blocking+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence method for in vitro screening of Plasmodium transmission-blocking compounds.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (6), aac.02699-aac.02616 (2017).</li>
<li>Gaitán, X. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+merozoite+thrombospondin+related+anonymous+protein+%28MTRAP%29+of+Plasmodium+berghei+as+a+transmission-blocking+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Mem+Inst+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the merozoite thrombospondin related anonymous protein (MTRAP) of Plasmodium berghei as a transmission-blocking antigen.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. , 119(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. D8418</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism Version 10.0.0 für Windows</td><td></td><td></td><td>GraphPad Software, Boston, Massachusetts, USA</td></tr><tr><td>Heparin-Natriumsalz aus der Darmschleimhaut von Schweinen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. H3393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxanthin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. H9636</td><td></td></tr><tr><td>Mäuse</td><td>---</td><td>---</td><td>Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 3 bis 5 Wochen</td></tr><tr><td>Nano-Glo Luciferase Assay-System</td><td>Promega</td><td>Nr. N1110</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin &minus; Streptomycin &minus; Neomycin-Lösung stabilisiert</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. P4083</td><td></td></tr><tr><td>POLARStar Omega Mikroplatten-Reader&nbsp;</td><td>BMG Labtech</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Ergänzung</td><td>Thermo Scientific</td><td>61870036</td><td></td></tr><tr><td>Xanthurensäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D120804</td><td></td></tr></tbody></table>

ookluc: eine plasmodium berghei-linie zur identifizierung von transmissionsblockierenden verbindungen

Ookluc: A Plasmodium berghei Line for Identifying Transmission-blocking Compounds

Ookluc: Eine Plasmodium berghei-Linie zur Identifizierung von transmissionsblockierenden Verbindungen

Malaria remains a world health challenge; in 2023, 263 million cases and 597,000 deaths were reported around the globe. The parasite's life cycle is ...

ookluc-plasmodium-berghei-line-for-identifying-transmission-blocking

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Sobald ein Gen als potentiell feuerfesten für Malaria identifiziert wird, muss er für seine Rolle bei der Verhinderung Plasmodium-Infektionen innerhalb der Mücke ausgewertet werden. Dieses Protokoll zeigt, wie das Ausmaß der Plasmodium-Infektionen von Mücken getestet werden kann. Die Techniken für die Vorbereitung der gametocyte Kultur-, Membran-Fütterung Moskitos menschlichem Blut und Testen von viralen Titer in der Mücke Mitteldarm demonstriert.

Protokoll für Plasmodium falciparum-Infektionen in Mücken und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung

Malaria übertragende Mücken haben eine Reihe von epidemiologisch wichtigen Eigenschaften, die nur mit molekularen Techniken nachgewiesen werden können. Unter Verwendung einer MALDI-TOF-basierten SNP-Genotypisierungsplattform haben wir einen Assay entwickelt, mit dem mehrere Schlüsselmerkmale (Spezies, Insektizidresistenz, Parasiteninfektion und Wirtswahl) von Malariavektoren gleichzeitig nachgewiesen werden können.

Ein Multi-Nachweistest für Malaria tragenden Mücken

Wir beschreiben ein Mausmodell der experimentellen zerebralen Malaria und zeigen, wie entzündliche und mikrovaskuläre Pathologien in vivo mit Hilfe der Magnetresonanztomographie verfolgt werden können.

In vivo Verfolgung von Ödementwicklung und mikrovaskulärer Pathologie in einem Modell der experimentellen zerebralen Malaria mit Magnetresonanztomographie

Aufgrund der auffälligen Ähnlichkeiten des Lebenszyklus und der Biologie von Nagetier-Malariaparasiten mit menschlichen Malariaparasiten sind Nagetier-Malariamodelle für die Malariaforschung unverzichtbar geworden. Hierbei haben wir einige der wichtigsten Techniken standardisiert, die bei der phänotypischen Analyse von wildflebenden und transgenen Nagetier-Malaria-Arten verwendet werden.

Phänotypische Analyse von Nagetier Malaria Parasiten Asexual und Sexuelle Blutstadien und Mückenstadien

Detaillierte Untersuchungen an Mückenstadien von Malariaparasiten sind entscheidend, um wirksame Strategien zur Blockierung der Übertragung zu entwickeln. Dieses Protokoll zeigt, wie man infektiöse Gametozyten effektiv kultiviert und diese Gametozyten dann an Moskitos verfüttert, um Mückenstadien von P. falciparumzu erzeugen.

Plasmodium falciparum Gametozytenkultur und Mückeninfektion durch künstliche Membranfütterung

Fokussiertes Ionenstrahlfräsen zur Herstellung von glasartigen On-Grid-Lamellen aus tiefgefrorenen biologischen Proben für die Kryo-Elektronentomographie.

Präparation von Lamellen aus glasartigen biologischen Proben mit einem Zweistrahl-Rasterelektronenmikroskop für die Kryo-Elektronentomographie

Dieses Protokoll beschreibt einen Sandwich-Enzyme-linked Immunosorbent Assay zum Nachweis von Speicheldrüsen-Sporozoiten in Mücken. Unter Verwendung leicht verfügbarer monoklonaler Antikörper ermöglicht die Methode einen kostengünstigen Hochdurchsatznachweis von Mücken, die Plasmodium falciparum oder Plasmodium vivax tragen. Die Methode eignet sich für die Erforschung der Malariaübertragung, einschließlich Vektoruntersuchungen.

Nachweis von Plasmodium Sporozoiten in Anopheles-Mücken mit einem Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Der Standard Membrane Feeding Assay (SMFA) gilt als Goldstandard für die Bewertung und Identifizierung potenzieller Malariamittel. Dieses künstliche Fütterungssystem wird verwendet, um Moskitos zu infizieren, um die Auswirkungen solcher Verbindungen auf die Intensität und Prävalenz des Parasiten Plasmodium falciparum weiter zu bewerten.

Standard-Membran-Fütterungstest zum Nachweis von Plasmodium falciparum-Infektionen in Anopheles-Mückenvektoren

Hier beschreiben wir eine neue Methode, um die Mechanismen der zellulären Immunität gegen Plasmodien während der Blutphase der Infektion aufzuklären. Dabei handelt es sich um einen In-vitro-Assay , der die Abtötung infizierter roter Blutkörperchen durch zytotoxische Lymphozyten misst.

In vitro Untersuchung der Abtötung von Plasmodium-infizierten roten Blutkörperchen durch zytotoxische Lymphozyten

Malaria wird durch Inokulation des Sporozoitenstadiums von Plasmodium durch infizierte Stechmücken übertragen. Transgenes Plasmodium hat es uns ermöglicht, die Biologie der Malaria besser zu verstehen und hat direkt zur Entwicklung von Malaria-Impfstoffen beigetragen. In dieser Arbeit beschreiben wir eine optimierte Methodik zur Generierung transgener Plasmodium berghei-Sporozoite.

Gentechnisch veränderte Plasmodium berghei Sporozoiten

Die chemische Genetik beinhaltet die Substitution eines Gatekeeper-Rests durch eine Aminosäure, die eine andere Seitenkette am Zielort enthält. In dieser Arbeit haben wir einen mutierten Parasiten generiert, der ein hypomorphes Allel von cdpk1 enthält, und kompensatorische Signalwege identifiziert, die der Parasit im mutierten Hintergrund einnimmt.

Verständnis der Entwicklung von Kompensationswegen in einem mutierten Malariaparasiten mit hypomorphem Allel pflanzenähnlicher Kinasen

Erfahren Sie eine Hochdurchsatz-Methode zur Identifizierung von transmissionsblockierenden Verbindungen in Plasmodium berghei. Dieses Protokoll ermöglicht präzise IC50-Bestimmung und unterstützt Strategien zur Unterbrechung der Malaria-Übertragung.

Ookluc: Eine Plasmodium berghei-Linie zur Identifizierung von transmissionsblockierenden Verbindungen

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