Ookluc: Eine Plasmodium berghei-Linie zur Identifizierung von transmissionsblockierenden Verbindungen

Unsere Forschung zielt darauf ab, übertragungsblockierende Verbindungen und essentielle Gene in Plasmodium-Sexualstadien mit Hilfe eines Hochdurchsatzsystems zu identifizieren und zu charakterisieren, um neuartige Strategien zur Unterbrechung der Malariaübertragung zu unterstützen. Dieses Protokoll behebt den Mangel an standardisierten Hochdurchsatzmethoden zur Identifizierung von transmissionsblockierenden Verbindungen unter Verwendung einer transgenen P.berghei-Linie mit automatisiertem Nachweis der Parasitenentwicklung nach der Befruchtung in der Lumineszenzphase. Dieses Protokoll ermöglicht das Screening von Plasmodium-Sexualstadien, erkennt frühe transmissionsblockierende Verbindungen und unterstützt eine präzise IC50-Bestimmung, was Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden bietet.

Bereiten Sie zunächst die Verbindungsproben vor, indem Sie das Verbundmaterial mit Ookinetmedium auf ein Millimolar verdünnen. Bereiten Sie die Arbeitsproben vor, indem Sie diesen einmillimolaren Stamm in Ookinetmedium im Verhältnis eins zu 100 verdünnen, um eine Endkonzentration von 10 Mikromolar zu erreichen. Bereiten Sie für einen Assay ein endgültiges Volumen von 200 Mikrolitern einer Arbeitsprobe in doppelter Ausführung vor.

Ist die Verbindung in einem anderen Lösungsmittel als Wasser gelöst, so ist eine Kontrollprobe vorzubereiten, indem das Lösungsmittel im Ookinetmedium in der gleichen Menge verdünnt wird, die für die Probe verwendet wurde. Platzieren Sie unter Verwendung von zwei 96-Well-Platten 80 Mikroliter jeder Probe in dafür vorgesehene Vertiefungen für die Positivkontrolle, die Negativkontrolle, die Lösungsmittelkontrolle und die Testproben in Duplikaten gemäß dem angegebenen Layout. Geben Sie vier Mikroliter parasitiertes Mausblut in jeder Vertiefung im Verhältnis eins zu 20, mit Ausnahme der negativen Kontrollvertiefungen.

Homogenisieren Sie sanft durch Auf- und Abpipettieren. Für die Negativkontrolle geben Sie nicht infiziertes Mausblut im Verhältnis eins zu 20 in jede Vertiefung und homogenisieren Sie es vorsichtig durch Pipettieren. Legen Sie die Platten in einen auf 21 Grad Celsius eingestellten Inkubator und inkubieren Sie sie entweder sechs Stunden oder 24 Stunden lang.

Homogenisieren Sie nach der Inkubation jede Probe, indem Sie auf und ab pipettieren, um eine ordnungsgemäße Durchmischung des Blutmediums zu gewährleisten. Bereiten Sie die Mischung aus Lysepuffer und Luciferase-Substrat unmittelbar vor der Verwendung im Verhältnis eins zu 50 vor. Mischen Sie diese Lysepuffer-Substratmischung mit jeder Probe im Eins-zu-Eins-Verhältnis, um ein schonendes Mischen ohne Blasenbildung zu gewährleisten.

Inkubieren Sie die Platte drei bis fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie nun die Proben auf eine weiße 96-Well-Platte mit flachem Boden und messen Sie die Lumineszenz mit einem Plattenlesegerät. Zeichnen Sie nach dem Lumineszenz-Assay die vom Platten-Reader angezeigten Lumineszenz-Rohdaten auf.

Berechnen Sie mithilfe einer Tabelle den Mittelwert jeder Messung anhand der angegebenen Formel. Ersetzen Sie XX durch die Adresse der ersten Messzelle und YY durch die Adresse der zweiten Messzelle. Wiederholen Sie die Formel für alle Proben.

Wandeln Sie die Daten mit der angegebenen Formel in eine prozentuale Hemmung um, wobei A der relative Wert der Lichteinheit und B der relative Wert der Kontrolllichteinheit ist. Wählen Sie Verbindungen aus, die eine Hemmung von mehr als 95 % für die Hemmkonzentration von 50 % aufweisen. Nach der Infektion von Mäusen mit Ookluc und dem Sammeln von parasitiertem Blut bereiten Sie Verbindungsproben mit Ookinetmedium als Verdünnungsmittel in der Anfangskonzentration vor, die eine 100%ige Hemmung der Umwandlung zeigte.

Pipettieren Sie die Proben in dreifacher Ausfertigung in eine 96-Well-Platte nach dem angegebenen Layout. Mit einer Pipette werden zweifache Reihenverdünnungen durchgeführt, indem 80 Mikroliter aus der Vertiefung D1 in D2 überführt werden, gründlich gemischt werden, dann 80 Mikroliter von D2 nach D3 überführt und dieser Vorgang bis D12 fortgesetzt wird. Entsorgen Sie die letzten 80 Mikroliter, die aus D12 entfernt wurden, um 80 Mikroliter pro Vertiefung zu erhalten.

Geben Sie nun parasitiertes Mausblut im Verhältnis eins zu 20 in jede Vertiefung und homogenisieren Sie es vorsichtig durch Pipettieren. In den Negativkontrollvertiefungen wird nicht infiziertes Mausblut im Verhältnis eins zu 20 zugegeben und vorsichtig homogenisiert. Legen Sie die Platte in einen auf 21 Grad Celsius eingestellten Inkubator und inkubieren Sie sie entweder sechs oder 24 Stunden lang, bevor Sie den Lumineszenz-Assay durchführen.

Öffnen Sie nach der Berechnung der prozentualen Hemmung die Analysesoftware und erstellen Sie eine XY-Tabelle zum Zeichnen. Legen Sie die Y-Achse so fest, dass drei Replikationswerte in nebeneinander angeordneten Unterspalten eingegeben werden. Fügen Sie die Daten in die Tabelle ein, wobei x für die Verbindungskonzentration und y für die prozentuale Hemmung steht.

Klicken Sie nun auf Analysieren. Wählen Sie Nichtlineare Regression, Kurvenanpassung und dann Dosis-Wirkungs-Kurven, Hemmung, gefolgt von Inhibitor vs. normalisierte Reaktion, variable Steigung, und klicken Sie auf OK. Zeigen Sie die Dosis-Wirkungs-Kurve im linken Bereich an und wenden Sie Anpassungen an, z. B. Änderungen an der Farbe oder dem Punktformat.

Suchen Sie die nichtlineare Anpassungstabelle, um den berechneten IC50 und das 95%-Konfidenzintervall zu ermitteln. Pyrimidinazepin 90 zeigte eine deutliche konzentrationsabhängige Hemmung der Zielaktivität mit einer Hemmung von mehr als 95 %, die bei Konzentrationen von 0,125 bis einem Mikromolar beobachtet wurde, und einen vollständigen Aktivitätsverlust unter 0,007 Mikromolar, was auf einen scharfen Schwelleneffekt in seiner inhibitorischen Reaktion hindeutet. Die Dosis-Wirkungs-Kurve, die an die Daten von Pyrimidinazepin 90 angepasst wurde, ergab einen IC50-Wert von 0,013 Mikromolaren, was auf eine hohe Wirksamkeit bei der Hemmung der angestrebten Aktivität hinweist.