Schnelle Dissektion und Dissoziation des olfaktorischen Epithels der Maus für Einzelkernsuspensionen
1. August 2025
Dieser Artikel bietet ein optimiertes Protokoll für die Dissektion und Dissoziation von murinem Geruchsepithel zum Zwecke der Einzelkern-RNA-Sequenzierung.
Hier stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, das die schnelle Dissektion des olfaktorischen Epithels zum Zwecke der Einzelzell- oder Einzelkernsequenzierung unterstützen soll. Unser Protokoll legt Wert auf Geschwindigkeit und Leichtigkeit des Lernens und ist ideal für Einzelzellanwendungen, bei denen das Gewebe homogenisiert wird und eine schnelle Dissektion im Gegensatz zu früheren Methoden wichtiger ist als die Erhaltung der anatomischen Integrität. Unser Protokoll ermöglicht eine schnelle und benutzerfreundliche Dissektion des Riechepithels, um Einzelzellsequenzierungsstudien zu erleichtern und die Erforschung der genetischen Grundlagen des Geruchssystems zu fördern.
Besorge dir zunächst den enthäuteten Kopf einer Maus. Verwenden Sie eine feine, scharfe Schere, um zwei Schnitte zu machen, um die Jochbögen beidseitig vom Plattenepithelknochen zu lösen, indem Sie eine Scherenspitze in die hintere Orbita und die andere neben den Gehörgang setzen. Machen Sie einen flachen Schnitt von Orbita zu Orbita entlang der vordersten Seite des Stirnbeins und schneiden Sie nur die dorsale Oberfläche des Stirnbeins bis zu einer Tiefe von etwa einem bis zwei Millimetern ein.
Schneiden Sie nun entlang der Mittellinie des Schädels vom Foramen magnum durch die sagittalen und interfrontalen Nähte bis zu dem zuvor vorgenommenen interorbitalen Schnitt. Führen Sie eine Pinzette in den Mittellinienschnitt ein und ziehen Sie eine Halbkugel des Schädelgewölbes seitlich fest. Während Sie das Nasenbein und die Schneidezähne festhalten, verwenden Sie eine Pinzette, um das kontralaterale Schädelgewölbe zu lösen.
Lassen Sie zu, dass das Gehirn, einschließlich der Riechkolben, mit der Knochenhälfte entfernt wird, während es weggerissen wird. Verwenden Sie anschließend eine Knochenzange oder einen Rongeurs, um das verbleibende Stirnbein und den Prämaxillarknochen bis zur Basis der Schneidezähne zu entfernen. Entlang der frontonasalen Naht mit einer Knochenzange schneiden, um das Nasenbein von der cribriformen Platte zu lösen.
Heben Sie dann mit einer Pinzette das Nasenbein von der cribriformen Platte ab, um das Riechepithel freizulegen. Wenn übrig gebliebener Prämaxillarknochen das dorsale Riechepithel verstopft, entfernen Sie ihn, bevor Sie fortfahren. Befestigen Sie nun mit einer Pinzette mit feiner Spitze vorsichtig den dorsalen Aspekt des Nasenseptums an seiner Verbindung mit der cribriformen Platte und ziehen Sie ihn nach hinten.
Das wichtigste olfaktorische Epithel bricht als völlig intakte Struktur aus. Die bildgebende Durchflusszytometrie ergab, dass 53,69 % aller Ereignisse Zellkerne waren. Von den Einzelkernen wiesen 53,89 % eine hohe Zirkularität auf.
Die Qualitätskontrollplots bestätigten eine konsistente Sequenzierungsqualität über vier Proben hinweg mit einheitlichen Verteilungen der Gen- und Mitochondrienzahl. Die Markergene des Datensatzes stimmen mit vielen der gut etablierten Markergene für jeden Zelltyp überein.
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Übersicht
In diesem Artikel wird ein Protokoll für die schnelle Dissektion und Dissociation des murinen Riechepithels beschrieben, das auf die Durchführung einer Einzelkern-RNA-Sequenzierung abzielt. Die Methode legt den Schwerpunkt auf Schnelligkeit und einfache Durchführung und eignet sich daher für Anwendungen, bei denen eine Gewebehomogenisierung erforderlich ist.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Genomik
- Forschung zum Geruchssystem
Hintergrund
- Die Einzelzell- und Einzelkern-RNA-Sequenzierung ist entscheidend für das Verständnis der zellulären Diversität.
- Bisherige Dissektionsmethoden legten den Schwerpunkt auf anatomische Integrität, was für bestimmte Anwendungen möglicherweise nicht ideal ist.
- Das olfaktorische Epithel spielt eine grundlegende Rolle bei der olfaktorischen sensorischen Transduktion.
- Die Verbesserung von Dissektionstechniken kann die Effizienz genetischer Studien im Zusammenhang mit dem Geruchssinn erhöhen.
Zweck der Studie
- Eine benutzerfreundliche Anleitung für die Dissektion des Riechepithels bereitstellen.
- Die schnelle Gewebeverarbeitung für Einzelzellsequenzierungsuntersuchungen erleichtern.
- Die Forschung zu den genetischen Mechanismen des Geruchssystems fördern.
Verwendete Methoden
- Die Methode beinhaltet die Dissektion des Riechepithels aus murinen Modellen.
- Dieses biologische Modell umfasst das murine Riechsystem und unterstreicht die Notwendigkeit einer schnellen Gewinnung.
- Die Entfernung von Knochenmaterial und eine sorgfältige Handhabung gewährleisten die Integrität des primären Riechepithels.
- Zu den entscheidenden Schritten gehören Inzisionen am Schädelknochen und die Isolierung der Riechstrukturen.
- Qualitätskontrollen wurden eingeführt, um eine gleichbleibende Sequenzierungsqualität sicherzustellen.
Hauptergebnisse
- Über die Hälfte der gesammelten Ereignisse wurden als Kerne identifiziert, was auf eine erfolgreiche Isolierung hinweist.
- Die hohe Kreisförmigkeit der Kerne deutet auf eine qualitativ hochwertige Erhaltung während der Dissektion hin.
- Die Qualitätskontrolle zeigte gleichmäßige Verteilungen von Genen und Mitochondrien.
- Markergene stimmten mit etablierten Referenzwerten für Zelltypen überein.
Schlussfolgerungen
- Die Studie stellt eine schnelle methodische Weiterentwicklung zur Dissektion des Riechepithels vor.
- Sie trägt durch die ermöglichte effiziente Einzelkernsequenzierung zum Verständnis genetischer Faktoren in der Geruchswahrnehmung bei.
- Dieses Protokoll könnte die Analyse neuronaler Mechanismen und der Plastizität in sensorischen Systemen verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Schnelle und reproduzierbare Herstellung von Einzelkern-Suspensionen aus dem murinen Riechepithel ermöglicht eine hochauflösende molekulare Charakterisierung unterschiedlicher neuronaler und Vorläuferpopulationen. Dieses Protokoll behebt einen zentralen Engpass in der Einzelzell-Genomik, indem es die Gewebeentnahmedauer minimiert und die Integrität der Zellkerne erhält, was eine zuverlässige Zielvalidierung und mechanistische Ent风险bewertung in sensorischen Neurowissenschafts-Pipelines unterstützt. Die Methode steigert die Vorhersagesicherheit für frühe Entdeckungen und translationsorientierte Forschung, die auf der genetischen Grundlage von Riechfunktion und Regeneration basiert.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht eine schnelle Hypothesenprüfung der Genexpression in olfaktorischen Sinnesneuronen und deren Vorläuferzellen.
- Unterstützt die funktionelle Validierung von Zielstrukturen, indem die Kernqualität für die nachgeschaltete Sequenzierung erhalten bleibt.
- Erleichtert die mechanistische Risikominimierung von Kandidatenwegen, die an der Erneuerung von Sinnesneuronen beteiligt sind.
- Steigert die Vorhersagesicherheit bei der Priorisierung von Zielstrukturen in der Forschung zum Sinnessystem.
Screening und Assay-Entwicklung
- Liefert hochwertige Einzelzellkern-Suspensionen, die für standardisierte Einzelzell-Sequenzier-Workflows geeignet sind.
- Gewährleistet Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit über mehrere Proben und experimentelle Durchläufe hinweg.
- Bietet quantitative Ausgabedaten, einschließlich Kernausbeute und Qualitätsmetriken, zur Bewertung des Assays.
- Ermöglicht eine zuverlässige Beurteilung von Genexpressionsänderungen als Reaktion auf experimentelle Störungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Ermöglicht die Untersuchung von Riechstörungen und -regeneration an krankheitsrelevanten Modellen.
- Unterstützt die Kontinuität von genomischen Entdeckungen bis zur präklinischen Validierung molekularer Zielstrukturen.
- Verringert biologische Risiken durch die Bereitstellung konsistenter, hochwertiger Daten zur Identifizierung translationsrelevanter Biomarker.
- Erleichtert risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung in Portfolios der sensorischen Neurowissenschaften.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll verbindet den Bereich der frühen Entdeckung mit der Leitstrukturfeststellung und ermöglicht einen nahtlosen Übergang von der Gewebeextraktion zur Einzelkernsequenzierung und nachfolgenden Analysen.
- Entdeckungsbiochemie: Beschleunigt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen in der Forschung zum Geruchssystem.
- Screening: Liefert assaysbereite nukleäre Suspensionen mit validierten Qualitätskennzahlen.
- Analytik: Bietet quantitative Messwerte zum Vergleich der Genexpression zwischen Zelltypen und Bedingungen.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Biomarkerabstimmung und Entwicklung präklinischer Modelle für Geruchsstörungen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert einen standardisierten, wiederverwendbaren Workflow für die Einzelkernpräparation in sensorischen Geweben.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagegenauigkeit und verringert mechanistische Unschärfen bei der Zielvalidierung.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Durchsatzleistung in der Einzelzell-Genomik.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen und kapitaleffizientes Portfolio-Management.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Programmen in der sensorischen Neurowissenschaft.
Durchführungsüberlegungen
- Benötigt technisches Fachwissen bei der schnellen Dissektion und Isolierung von Kernen aus komplexen anatomischen Strukturen.
- Setzt Zugang zu spezialisierten Geräten für die Gewebeprozessierung und Qualitätskontrolle voraus (z. B. bildgebende Durchflusszytometrie).
- Erfordert eine Standardisierung über mehrere Arbeitsgruppen hinweg, um die Reproduzierbarkeit zwischen Studien und Bedienern sicherzustellen.
- Kann Anpassungen erfordern, wenn sie auf andere Gewebetypen oder Modellsysteme mit unterschiedlichen anatomischen Merkmalen angewendet wird.
- Die auf Geschwindigkeit ausgelegte Gewinnung kann den Einsatz in Anwendungen einschränken, bei denen die anatomische Integrität entscheidend ist.
