Bildgestützte In-vivo-Verfolgung von transplantierten distalen Lungenepithel-Vorläuferzellen für Lungenfibrose mittels Magnetpulver-Bildgebung

Diese Studie konzentriert sich auf das intratracheale Intubationsprotokoll als entscheidende Abgabemethode für die Lungenzelltherapie, mit dem Ziel, die Zelltransplantation und nicht-invasive Nachverfolgung mittels Magnetteilchentomographie bei der Lungenfibrose zu optimieren. Unser Protokoll adressiert den Mangel an nicht-invasiven Methoden zur in-vivo-Verfolgung der Zelltherapie bei Lungenfibrose, indem intratracheale Isolierung mit Magnetpartikelbildgebung kombiniert wird, um die Zellverteilung zu überwachen. Unser Protokoll bietet eine präzise, lokalisierte Zellabgabe durch intratracheale Installation und überlegene Verfolgung mittels Magnetteilchenbildgebung, was eine hohe Empfindlichkeit und Echtzeitaufnahme ohne Hintergrundgeräusche ermöglicht.

Zu Beginn wiegen Sie eine 12 Wochen alte männliche NOD- oder SCID-Maus, um die erforderliche Dosis Bleomycin zu berechnen. Bereiten Sie die Bleomycin-Lösung in steriler Kochsalzlösung mit der gewünschten Konzentration auf ein Endvolumen von 50 Mikrolitern in einem 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr vor. Dann lege die Lösung in eine Pipette ein.

Laden Sie eine Spritze mit 200 Mikrolitern Luft vor, um sicherzustellen, dass das gesamte Flüssigkeitsvolumen während der Injektion in die Luftröhre ausgestoßen wird. Nach der Betäubung der Maus bauen Sie das Faserlichtintubationsset mit der optischen Fasersonde zusammen, die durch das Laryngoskop und den Katheter geführt wird. Kneifen Sie die Zehe des Tieres, um eine ausreichende Narkose zu gewährleisten, und tragen Sie bei Narkose eine Augensalbe auf beide Augen auf.

Hängen Sie die Maus an ihren Schneidezähnen in Rückenposition auf einem schrägen Nagerintubationsstand. Mit einer stumpfen Zange greifen Sie die Zunge und bewegen Sie sie vorsichtig nach oben und nach links, um den Kehlkopf für eine klare Sichtbarkeit freizulegen. Schalten Sie die Glasfasersonde ein und führen Sie sie in den Mund, um sich der Luftröhre zu nähern.

Verwenden Sie die Vergrößerung des Laryngoskops, um die Sichtbarkeit zu verbessern und die Stimmbänder an der Trachealöffnung zu identifizieren. Führen Sie den Katheter in die Luftröhrenöffnung ein und entfernen Sie vorsichtig das Laryngoskop. Dann setzen Sie einen 20-Mikroliter-Kochsalztröpfchen am oberen Ende des Katheters ein.

Schließen Sie die vorgeladene Spritze mit 200 Mikrolitern Luft an und drücken Sie den Tropfen in die Luftröhre. Anschließend füllen Sie den Katheter mit bis zu 50 Mikrolitern Bleomycin und geben Sie es mit der luftgefüllten Spritze ein. Halten Sie den Katheter 5–7 Sekunden an Ort und Stelle, um einen Rückfluss der Flüssigkeit aus der Luftröhre zu verhindern.

Dann entferne vorsichtig den Katheter. Halten Sie die Maus mindestens 30 Sekunden lang auf dem Intubationsstand in derselben Position. Dann nimm die Maus vom Stand und stelle sie in einen Erholkäfig, der auf einem Heizkissen positioniert ist.

Überwachen Sie die Maus kontinuierlich, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hat. Erhalten Sie nanopartikel-markierte menschliche Atemwegepithelzellen von Patienten mit idiopathischer Lungenfibrose. 72 Stunden nach der Bleomycin-Installation wird die Maus erneut betäubt und das intratracheale Installationsverfahren wiederholt, um 50.000 Zellen in 50 Mikrolitern Zellsuspension zu verabreichen.

Lassen Sie die Maus sich mindestens 20 Minuten erholen, bevor die Magnetteilchenbildgebung durchgeführt wird. Richten Sie das Mausbett im Magnetpartikelscanner ein, nachdem Sie die Anästhesieleitung unter dem Bett durch die richtigen Stecker geführt haben. Während die Maus betäubt wird, bereiten Sie den Magnetteilchenbildscanner vor.

Nach Bestätigung der ausreichenden Anästhesie mit einem Zehenkneiftest positionieren Sie die Maus vorsichtig auf dem Magnetpartikelbildgebiet. Drücke das Bett mit der Maus in den Scannerlauf und klicke in der Softwareoberfläche auf Start Scan, um die Bildgebung zu starten. Nachdem der Scan abgeschlossen ist, nehmen Sie die Maus aus dem Magnetpartikelbildgebungsbett und setzen Sie sie in einen auf einem Heizkissen positionierten Rettungskäfig.

Analysieren Sie schließlich die aufgenommenen Bilder mit einer Bildanalysesoftware. Die 2D-Magnetpartikelabbildung oder MPI-Signalintensität stieg proportional zur Konzentration des Eisenoxid-Tracers über alle getesteten Zellzählungen hinweg. Eine Konzentration von 250 Mikrogramm pro Milliliter wurde als optimale Markierungskonzentration ausgewählt.

Die Fluoreszenzmikroskopie bestätigte eine erfolgreiche In-vitro-Markierung der Zellen und zeigte rote Dextran-Signale im Zytoplasma und in blau DAPI-gefärbten Kernen. Die Signalintensitäten in 2D-MPI-Bildern nahmen mit der Anzahl der markierten Zellen zu, was eine positive Korrelation zwischen Signal und Zellanzahl bestätigt. Auf dieser Grundlage wurden 50.000 Zellen für die Transplantation ausgewählt.

Das Bild der leeren Bettsteuerung zeigte kein Hintergrund-MPI-Signal, was die Spezifität des Scanners gegenüber beschrifteten Zellen bestätigte. Die vier beobachteten Signale entsprechen treuen Markern, die als Steuerung dienen. Die erfolgreiche Transplantation markierter Zellen in die Lunge erzeugte ein deutliches, schmetterlingsförmiges MPI-Signal mit sichtbarer Verteilung in beiden Lungen, was eine effektive intratracheale Lieferung bestätigte.

Eine unvollständige Zellinstallation führte dazu, dass Signale sowohl in der Lunge als auch im Nacken auftraten, was auf eine Leckage aufgrund vorzeitiger Katheterentfernung hinweist. Die falsche Platzierung des Katheters in die Speiseröhre statt in die Luftröhre führte dazu, dass das MPI-Signal weiter unten im Bauchraum erschien, was auf die Ablagerung von Zellen im Magen hinweist. 14 Tage nach der Transplantation bestätigte ex-vivo-Bildgebung der entfernten Lungen das Fortbestehen markierter Zellen.

Unsere Ergebnisse werden die diagnostische Genauigkeit verbessern und die Entwicklung gezielter Therapien für Lungenerkrankungen ermöglichen, einschließlich Stammzelltherapie, was den Fortschritt und die Innovation in der Lungenbildgebung und verwandten biomedizinischen Bereichen beschleunigt. Unser Labor konzentriert sich darauf, stammzellbasierte Therapien für Lungenfibrose zu ergänzen, nicht-invasive Bildgebungstechniken zu verbessern und gleichzeitig die Zellabgabe zu optimieren und die therapeutische Wirksamkeit der Lungenfibrose zu überwachen.