Ein ex vivo Explantatmodell zur Untersuchung von glialen Wechselwirkungen in der Netzhaut der Maus

Wir wollen die Neuroinflammation beim Glaukom verstehen, die weltweit die häufigste Ursache für irreversible Erblindung ist. Konkret untersuchen wir, wie gliale Stützzellen in der Netzhaut den neuronalen Verlust während des Fortschreitens der Krankheit beeinflussen.

Es wird angenommen, dass Gliazellen wie Astrozyten und Mikroglia das Fortschreiten des Glaukoms beeinflussen, aber viele der Werkzeuge, die zur Untersuchung der neuronalen Funktion in lebenden Tiermodellen verwendet werden, sind für diese Zellen ungeeignet. Retinale Explantate werden verwendet, um Neuroinflammation und Gliafunktion zu untersuchen, aber die Lernkurve ist steil. Unser Protokoll macht es zugänglicher und ermöglicht hoffentlich eine breitere Akzeptanz der Technik.

Im Vergleich zu herkömmlichen In-vitro-Zellkulturen bewahrt unser Explantat-Ansatz die natürliche Umgebung für Zellen in der inneren Netzhaut besser und ermöglicht eine genauere Untersuchung ihrer physiologischen Funktionen.

[Erzähler] Legen Sie zunächst das extrahierte Mausauge in eine Sezierschale, die mit sterilem PBS bei Raumtemperatur gefüllt ist. Identifizieren Sie einen geeigneten Haltepunkt und fassen Sie ihn mit einer abgewinkelten Pinzette an, positionieren Sie dann das Auge vorsichtig auf dem untergetauchten Labortuch, während Sie sicherstellen, dass die vorder-hintere Achse von der Hornhaut zum Sehnerv horizontal positioniert ist. Während Sie einen festen Halt mit einer abgewinkelten Pinzette beibehalten, verwenden Sie die Spitze eines Skalpells mit der Nummer 11, um einen Schnitt parallel und etwa 0,5 Millimeter hinter dem Limbus zu machen, wo die Hornhaut zur Sklera übergeht. Führen Sie eine Klinge der Federschere in die Kugel ein und schneiden Sie zirkumlimbal um das Auge herum, wobei Sie sie bei Bedarf mit einer Pinzette neu positionieren. Nach Abschluss des zirkumlimbalen Schnitts wird das vordere Augensegment und die Linse mit einer Pinzette entfernt. Bleibt ein langes Stück Sehnerv übrig, schneiden Sie es mit einer feinen Schere auf eine Länge von ein bis zwei Millimetern ab. Drehen Sie dann die Augenmuschel so, dass sie nach oben zeigt, um eine visuelle Inspektion zu ermöglichen und die Glaskörperentfernung zu erleichtern. Verwenden Sie weiterhin eine abgewinkelte Pinzette, um die Augenmuschel zu immobilisieren, und untersuchen Sie die Netzhaut auf sichtbare Schäden und untersuchen Sie die Glaskörperkammer auf pigmentierte Zelltrümmer aus dem retinalen Pigmentepithel oder der Aderhaut. Spülen Sie die Glaskammer mit einer modifizierten Transferpipette mit PBS und halten Sie die Pipettenspitze unter Wasser, um Luftblasen zu vermeiden. Entfernen Sie dann mit einem feinen Aquarellpinsel vorsichtig größere Ablagerungen und minimieren Sie dabei den Kontakt mit der Netzhaut. Bei hartnäckigen Ablagerungen verwenden Sie vorsichtig eine Pinzette mit feiner Spitze und vermeiden Sie den direkten Metallkontakt mit der Netzhaut. Nachdem Sie sichtbare Ablagerungen entfernt haben, spülen Sie die Glaskammer drei- bis fünfmal mit PBS aus der Transferpipette und suchen Sie mit der feinen Bürste in der Nähe der Peripherie nach verbleibenden Ziliarkörperelementen, wobei Sie den Glaskörper durch den Widerstand an den Bürstenfasern erkennen. Wenn Glaskörpertaschen übrig bleiben, streichen Sie mit der Bürste nach außen in Richtung Peripherie und halten Sie die Fasern in einem flachen Winkel, um Netzhautschäden zu vermeiden. Halten Sie eine Pinzette in einer geschlossenen Position, wobei sich die Spitzen berühren, und führen Sie sie vorsichtig zwischen Netzhaut und Aderhaut ein, wobei Sie die natürlichen Lücken nutzen, die sich bei der Handhabung bilden. Verwenden Sie die flachen Arme der Pinzette, um den Raum zwischen Netzhaut und Aderhaut allmählich zu vergrößern, bis eine vollständige Trennung erreicht ist. Fahren Sie mit der Stabilisierung der Probe mit einer Pinzette fort, während Sie mit einem zweiten Paar die Augenmuschel, einschließlich der Sklera und der Aderhaut, vorsichtig nach unten ziehen. Wenn die Netzhaut mit der Augenmuschel nach unten sinkt, verwenden Sie die Pinzette, um alle verbleibenden Verbindungspunkte vorsichtig zu sondieren und zu lösen, wobei Sie den Sehnervenkopf vermeiden. Halten Sie dann, während die Netzhaut noch am Sehnervenkopf verankert ist, das Gewebe ruhig und verwenden Sie die zweite Pinzette, um die Augenmuschel unter dem Sehnervenkopf zu bündeln. Überprüfen, um sicherzustellen, dass die retinale Peripherie nicht aufgrund von Glaskörperresten gefaltet ist, insbesondere an Stellen, an denen Ziliarkörper verbleibt. Spülen Sie die Kammer bei Bedarf mit einer Transferpipette mit PBS und verwenden Sie die Bürste, um gefaltete Netzhaut vorsichtig zu entrollen und überschüssigen Glaskörper zu entfernen. Nachdem die Netzhaut von beiden Seiten freigelegt wurde, führen Sie mit einer Federschere eine Reihe von Entlastungsschnitten in einem Abstand von etwa 90 Grad von der Netzhautperipherie in Richtung des Sehnervenkopfes durch. Während Sie das untergetauchte Gewebe halten, ziehen Sie das Labortuch mit einer Pinzette seitlich von der Probe weg und entfernen Sie es aus der Schale, ohne die Netzhaut zu berühren. Während Sie die Netzhaut an Ort und Stelle halten, durchtrennen Sie mit der Federschere den Sehnerv direkt unter der Netzhaut. Heben Sie dann vorsichtig das restliche Augenmuscheltuch an und entfernen Sie es aus der Schale. Füllen Sie nun eine 35-Millimeter-Petrischale mit PBS und platzieren Sie mit einer Pinzette ein Filterquadrat am Boden, wobei die raue, matte Seite nach oben zeigt, um Falten zu vermeiden. Anschließend wird die Netzhaut mit der Transferpipette vorsichtig abgesaugt und in die Petrischale übertragen. Richten Sie die Netzhaut mit dem Pinsel mit der Innenfläche nach oben aus und positionieren Sie sie direkt über dem Filterquadrat. Saugen Sie PBS langsam ab, um die Netzhaut auf den Filter abzusenken. Sobald die Netzhaut auf dem Filter sitzt, rollen Sie mit der Bürste vorsichtig alle peripheren Falten ab. Passen Sie den PBS-Wert an, um die Stabilität der Netzhaut und die Hydratation auszugleichen und eine reibungslose Bewegung der Bürste zu ermöglichen, ohne das Gewebe auszutrocknen. Verwenden Sie nun die Transferpipette, um PBS aus etwa einem Zentimeter Höhe zu tropfen, um die Oberfläche zu spülen und die Netzhaut erneut auf Schmutz zu untersuchen. Schließen Sie den Deckel der 35-Millimeter-Schale und tragen Sie sie zur Biosicherheitswerkbank. Stellen Sie die geschlossene Schale in die Biosicherheitswerkbank, ohne mit Innenoberflächen oder Geräten in Berührung zu kommen. Sterilisieren oder ersetzen Sie die Handschuhe beim Übergang zur aseptischen Arbeit und überführen Sie die mit Explantatmedien vorgeladene Sechs-Well-Platte aus dem Inkubator in die Biosicherheitswerkbank. Entfernen Sie im Schrank den Deckel der 35-Millimeter-Schüssel und heben Sie das Filterquadrat mit einer abgewinkelten Pinzette an, ohne die Netzhaut zu berühren. Öffnen Sie dann die Sechs-Well-Platte und senken Sie den Filter vorsichtig auf die Mitte des Einsatzes in einer Vertiefung ab und tauchen Sie ihn langsam in das Medium ein. Sobald sich die Netzhaut vom Filter trennt, schieben Sie den Filter langsam zur Seite und entfernen Sie ihn mit einer abgewinkelten Pinzette aus der Vertiefung. Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipette, um 500 Mikroliter Medium aus dem Einsatz zu aspirieren, wobei die Netzhaut zwischen dem Einsatz und der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche eingeklemmt wird. Setzen Sie abschließend den Deckel auf die Sechs-Well-Platte und legen Sie ihn wieder in den Inkubator, um sicherzustellen, dass die Netzhaut in der Vertiefung zentriert bleibt. Um großflächige Veränderungen der retinalen Gliazellen zu untersuchen, wurden dreitägig explantierte Netzhäute mit Scheinexplantaten verglichen, die unmittelbar nach der Isolierung fixiert wurden, anstatt kultiviert zu werden. Mikroglia in Schein-Netzhäuten zeigten ein regelmäßiges, nicht überlappendes Verteilungsmuster, während am dritten Tag die Organisation der explantierten Netzhaut unregelmäßig wurde und die Zellen gehäppt erschienen, was auf eine Migration hindeutet. Retinale Astrozyten in Scheinnetzhäuten zeigten eine enge Ausrichtung mit dem Gefäßsystem, die nach drei Tagen in vitro deutlich abnahm. Die GFAP-Expression in Mueller-Zellen war schwach oder fehlte in Scheinnetzhaut, wurde aber am dritten Tag in vitro deutlich sichtbar, insbesondere in der Nähe von Geweberändern. Nach einem Tag in vitro zeigten die Mikroglia eine Prozessretraktion und frühe Aktivierungsanzeichen, die sich bis zum dritten Tag zu einer kompakten Amöbenmorphologie entwickelten. Nach 24 Stunden zeigte die mit Brn3a quantifizierte Zelldichte der retinalen Ganglien einen bescheidenen, aber deutlichen Rückgang der Kulturexplantate gegenüber den Scheinexplantaten. TMEM119, ein homöostatischer Mikrogliamarker, wurde in Scheinnetzhäuten stark exprimiert, war aber nach drei Tagen in vitro fast nicht mehr nachweisbar. Die CD206-Expression, die die Hyalozyten markiert, blieb nach dreitägiger In-vitro-Kultivierung stabil. Die GFAP-Färbung zeigte eine Astrozyten- und Mueller-Zell-Reaktivität an Stellen mechanischer Verletzungen, die während der Dissektion und Handhabung erlitten wurden.