Name: Labeling hESCs und hMSCs mit Eisenoxid-Nanopartikel für Non-Invasive in vivo-Tracking mit MR-Bildgebung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-31T21:32:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Erfahren Sie die Markierung humaner mesenchymaler und embryonaler Stammzellen mit eisenoxidhaltigen Kontrastmitteln für die nicht-invasive MR-Bildgebung in vivo. Diese Methode ermöglicht Forschern die Verfolgung injizierter Zellen zur Evaluierung neuer Stammzelltherapien.

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Dieses Projekt wurde von einem Leon J. Thal SEED Zuschuss aus dem California Institute for Regenerative Medicine unterstützt. Tobias Henning wurde durch eine Forschung von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, HE 4578/1-2) Stipendium finanziert. Wir wollen danken Juanito Meneses für seine Beratung auf die Kultur von humanen embryonalen Stammzellen.

Kennzeichnung von hMSC mit Ferucarbotran Dies ist die Technik für die Kennzeichnung von humanen mesenchymalen Stammzellen mit Ferucarbotran, eine Basis von Eisenoxid-Kontrastmittel für die MR-Bildgebung: <ol><li> Um zu beginnen, Platte die Zellen 18-24 Stunden vor der Etikettierung Verfahren in T75 Flaschen bei einer Konfluenz von 80%. Wenn Sie eine andere Kulturschale zu verwenden, ist dies entspricht etwa 10000 Zellen pro cm 2. </li><li> Am nächsten Tag mit der Vorbereitung der Kennzeichnung Medien durch Zugabe von 30 ul von Resovist zu 8 ml Serum freie Medien zu starten. Dies wird eine T75-Kolben bei 80% Konfluenz Label, das entspricht einer Konzentration von 100 ug Fe / ml Medium. </li><li> Nehmen Sie den Kulturmedien und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS oder Serum-freien Medien. Dies geschieht, um loszuwerden, verbleibende Serumproteine ​​und andere Bestandteile der Medien, dass das Kontrastmittel und Einfluss Labelingeffizienz binden konnte. </li><li> Fügen Sie die Kennzeichnung Medien in den Kolben und steckte die Flasche zurück in den Inkubator. </li><li> Nach 2 Stunden, fügen 2ml FCS, so dass eine Endkonzentration von 20% FCS erreicht wird. Dies geschieht, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht empfangen Reiz zu unterscheiden, sondern in ihrer gewohnten Umgebung zu wachsen. </li><li> Inkubieren Sie die Zellen über 18 Stunden. Dies geschieht am besten über Nacht. </li><li> Am nächsten Tag, waschen Sie die Zellen mit PBS, dann trypsinize sie wie gewohnt. </li><li> Sobald trypsiniert, muss die Zellsuspension 3 mal gewaschen werden, um loszuwerden, residual, frei Kontrastmittel in den Medien. Dies ist mit PBS Zentrifugieren der Zellen bei 400 rcf für 5 Minuten erledigt. </li><li> Die endgültige Zellpellet kann resuspendiert und ist bereit für weitere Experimente. </li><li> Zählen Sie die Zellen nun, wie einige vielleicht während der letzten Waschschritte verloren gegangen. Auch führen die Lebensfähigkeit Tests an dieser Stelle mit dem Trypanblau-Ausschluss-Assay und einige Proben für die massenspektrometrische Analyse über die Etikettierung Effizienz zu messen. </li></ol> Kennzeichnung von humanen embryonalen Stammzellen mit Ferumoxides <ol><li> Zu Beginn der Platte hESC in 10cm Gerichte, wie gewohnt. Diese Gerichte sind vorbeschichtet mit Gelatine und bestrahlten Feeder-Zellen auf ihnen. Sie können dieses Protokoll für Feeder-freien Kulturen zu nutzen. </li><li> Lassen Sie die hESC legen und wachsen etwa 3-4 Tage, so dass sie mittelgroße Kolonien zu bilden. Während dieser Zeit sicherzustellen, dass die Kolonien nicht zu groß werden, da größere Kolonien schwerer zu brechen später. </li><li> Differenzierte Zellen können diese Kulturen verunreinigen, so abhängig von der Sauberkeit der Kolonien, müssen Sie unter Umständen loswerden differenzierten Kulturen durch Dissektion. </li><li> Bereiten Sie die Kennzeichnung Medien, dass der Ferumoxides besteht bei einer Konzentration von 100μg/ml und voller hESC Medien. Dazu mischen wir 89μl Ferumoxides und 10 ml vollem Wachstum Medien. </li><li> Waschen Sie die Teller einmal mit kompletter Medien. </li><li> 10 ml Kennzeichnung Medien pro Gericht und inkubieren Sie die Zellen für 4 Stunden. </li><li> Nun ist die Kennzeichnung zu vervollständigen. Im nächsten Schritt ist es notwendig, die Zellen waschen und eine einzige Zellsuspension für die weitere Verwendung. Hierzu wird zunächst gründlich die Schale mit PBS. </li><li> Ersetzen Sie dann die PBS mit 5 ml 0,25% Trypsin und inkubieren in den Inkubator für 5 Minuten, oder bis die Zellen zu lösen. Es hilft, das Gericht häufig zu erschließen. </li><li> Die Zellen haben jetzt gelöst. Denken Sie daran, dass, wenn die Schale enthaltenen größeren Kolonien kann es einige Klumpen bleiben. </li><li> Um loszuwerden diese Klumpen, kann man die ganze Suspension einmal mit einer serologischen Pipette mischen, dann lassen Sie es für weitere 2 Minuten sitzen. </li><li> Wir verwenden keine einer Eppendorf-Pipette, wie wiederholt Saugen der Zellen durch die dünne Spitze können die Zellmembranen zu brechen. </li><li> Wenn verbleibende Klumpen vorhanden sind, kann man die Zellsuspension durch ein 40 um Zellsieb laufen. </li><li> Wenn alles funktioniert, eine einzige Zellsuspension Jetzt gibt es mit einer Menge Schutt gemischt, die aus der Gelatine-Beschichtung, die ESC-Matrix und tote Zellen. Um dies zu beheben, waschen Sie die Zellen zweimal durch Drehen sie sich bei 400 rcf für 5 Minuten und resuspendieren sie in voller Medien. </li><li> Nun muss der ESC von der bestrahlten Feeder-Zellen isoliert werden. Dies kann effizient durch Ausplattieren der Zellsuspension auf eine mit Gelatine beschichtete Gericht erfolgen. </li><li> Wenn das Gericht nicht manipuliert wird, werden alle Zellen Sediment ab, aber die Anleger werden anhängen schneller als der ESC. </li><li> Also, wenn der Überstand wird nach 45 Minuten gedauert, sollte es vor allem ESC, während die Anleger sollten vor allem auf der Schale angebracht werden. </li><li> Auf diese Weise wird eine einzelne Zelle Aussetzung der magnetisch markierte humane embryonale Stammzellen, die für weitere Experimente verwendet werden können erhalten werden. </li><li> Wie in den vorangegangenen Protokoll, an diesem Punkt, müssen Sie die Zellen zu zählen und nehmen Proben für die Lebensfähigkeit Beurteilung und Messung der Kennzeichnung Effizienz. </li></ol>

<ol><li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Oostendorp, R. A. J., Settles, M., Piontek, G., Metz, S., Heinzmann, U., Rummeny, E. J., Schlegel, J., Link, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+Hematopoietic+Progenitor+Cells+with+MR+Contrast+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Targeting of Hematopoietic Progenitor Cells with MR Contrast Agents.</a> 228, 760-767 (2003).</li>
<li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Piontek, G., Metz, S., Brauer, R., Debus, G., Corot, C., Schlegel, J., Link, T. M., Peschel, C., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+iron+oxide+labeled+human+hematopoietic+progenitor+cells+in+a+xenotransplant+model%3A+in+vivo+monitoring+using+clinical+magnetic+resonance+imaging+equipment%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Migration of iron oxide labeled human hematopoietic progenitor cells in a xenotransplant model: in vivo monitoring using clinical magnetic resonance imaging equipment.</a> Radiology. 234, 197-205 (2005).</li>
<li>Henning, T. D., Saborowski, O., Golovko, D., Boddington, S., Bauer, J. S., Fu, Y., Meier, R., Pietsch, H., Sennino, B., McDonald, D. M., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+labeling+with+the+positive+MR+contrast+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Gadofluorine+M.+Eur+Radiol%22%5BJournal%5D)">Cell labeling with the positive MR contrast agent.</a> Gadofluorine M. Eur Radiol. 17, 1226-1234 (2007).</li>
</ol>

Eine nicht-invasive Darstellung von Stammzellen ist von entscheidender Bedeutung für die Überwachung praktisch jede Stammzelle Therapie. Ein besseres Verständnis der in vivo Kinetik von markierten Stammzellen, wie visualisiert MR-Bildern, könnte dazu führen, den Weg zu einer rationalen und einer effizienteren Nutzung der Stammzellen-basierten Therapien. Da wir klinisch anwendbare Kontrastmittel-und Imaging-Techniken verwenden, sollten unsere vorgestellt Protokolle leicht übersetzbar zu Anwendungen bei Patienten. Potentielle klinische Anwend...

<table><tbody><tr><td>D-MEM High Glucose</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>Gelatine in PBS auf eine Endkonzentration von 0,1 % verdünnen</td></tr><tr><td>PBS (ohne Ca++ und Mg++)</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,05 %</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,25 %</td><td>Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>25200-114</td><td></td></tr><tr><td>FBS charakterisiert</td><td>Reagenz</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Zellfilter (40 &amp;mu;m Nylon)</td><td>Werkzeug</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serumersatz</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercapto&amp;#8211;ethanol</td><td>Reagenz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7522</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Reagenz</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Reagenz</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Ferumoxide (Endorem)</td><td>Reagenz</td><td>Guerbet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ferucarbotran (Resovist&amp;#174;)</td><td>Reagenz</td><td>Bayer AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

labeling hescs und hmscs mit eisenoxid-nanopartikel für non-invasive in vivo-tracking mit mr-bildgebung

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In den letzten Jahren hat die Stammzellenforschung zu einem besseren Verständnis der Entwicklungsbiologie, verschiedene Krankheiten und ihre möglichen Auswirkungen auf die regenerative Medizin geführt. Eine nicht-invasive Methode, um die transplantierten Stammzellen wiederholt Monitor in vivo würden enorm steigen unsere Fähigkeit, die Mechanismen zu verstehen, dass die Kontrolle Stammzellen Tod und identifizieren trophischen Faktoren und Signalwege, die Stammzell-Transplantation zu verbessern. MR-Bildgebung hat sich als ein wirksames Instrument für die In-vivo-Darstellung von Stammzellen mit der Nähe mikroskopischen anatomischen Auflösung. Um Stammzellen mit MR zu erkennen, müssen die Zellen mit Zell-spezifische MR-Kontrastmitteln markiert werden. Zu diesem Zweck sind Eisenoxid-Nanopartikel, wie superparamagnetische Eisenoxid-Partikel (SPIO), angewendet, die aufgrund ihrer hohen Sensitivität für die Zelle Erkennung und ihrer hervorragenden Biokompatibilität. SPIO Partikel bestehen aus einem Eisenoxid-Kern und einer Dextran, Carboxydextran oder Stärke Fell und Funktion durch die Schaffung lokaler Inhomogenitäten, dass eine verminderte Signal auf T2-gewichteten MRT-Bilder verursachen zusammen. Diese Präsentation wird Techniken zur Markierung von Stammzellen mit klinisch anwendbaren MR-Kontrastmittel für die nachfolgende nicht-invasive in vivo Verfolgung der markierten Zellen mit der MR-Bildgebung zu demonstrieren.

Für die Bewertung von neuen Stammzelltherapien ist es wichtig, nicht-invasiv Spur der injizierten Zellen in vivo. Dieses Video zeigt Ihnen, wie Sie humanen mesenchymalen und embryonalen Stammzellen mit Eisenoxid-Kontrastmittel in vivo für die nachfolgenden MR-Bildgebung in vivo-Label.

Labeling hESCs und hMSCs mit Eisenoxid-Nanopartikel für Non-Invasive in vivo-Tracking mit MR-Bildgebung

In den letzten Jahren hat die Stammzellenforschung zu einem besseren Verständnis der Entwicklungsbiologie, verschiedener Erkrankungen und der potenziellen Auswirkungen auf die regenerative ...

Willkommen im Labor von Dr. Haiku Dal Link. Wir danken dem California Institute of Regenerative Medicine für die Finanzierung dieses Projekts zur Bewertung neuer Stammzelltherapien. Es ist wichtig, die injizierten Zellen nicht-invasiv in vivo zu verfolgen.Dies ist möglich, indem die Zellen in vitro mit spezifischen oder multifunktionalen Kontrastmitteln für die MR-Bildgebung oder die optische Bildgebung markiert werden. In diesem Video wird gezeigt, wie humane mesenchymale und humane embryonale Stammzellen für eine anschließende in vivo-Bildgebung markiert werden. Hallo, ich bin Tobias Henning von der Forschungsgruppe für Kontrastmittel am Zentrum für molekulare und funktionelle Bildgebung der Abteilung für Radiologie an der University of California San Francisco.Heute werde ich Ihnen die Verfahren zur In-vitro-Markierung menschlicher mesenchymaler Stammzellen mit Peric und Carone sowie menschlicher embryonaler Stammzellen mit Phemoxiden vorstellen. Diese Technik ist nützlich, um injizierte Zellen in vivo zu lokalisieren oder Informationen über ihren Funktionszustand zu erhalten. Die Verfahren zur Zellmarkierung mit MRT-Kontrastmittel unterscheiden sich zwischen embryonalen und mes

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt Techniken für die Kennzeichnung von menschlichen embryonalen Stammzellen und mesenchymalen Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen. Diese Technik kann für eine in vivo Verfolgung der transplantierten Stammzellen mit optischen Bildgebung und zur histopathologischen Korrelation mit Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt werden.

Labeling Stammzellen mit fluoreszierenden Farbstoffen zur nicht-invasiven Detektion mit Optical Imaging

In diesem Video zeigen wir, wie man menschliche embryonale Stammzellen (hES) mit Manganchlorid (MnCl...

In-vitro-Markierung von humanen embryonalen Stammzellen für Magnetic Resonance Imaging

Ziel der Präsentation ist es, eine hohe Reproduzierbarkeit der Methode zur Matrix verbunden Stammzellen Implantate in Knorpeldefekte, die visualisiert werden MR-Bildgebung erzeugen kann demonstrieren. Stammzellen sind mit von der FDA zugelassene Ferumoxides mit Agarose, implantiert in Knorpeldefekte und abgebildet mit einem 7T MR-Scanner bezeichnet.

Die Implantation von Ferumoxides Labeled humanen mesenchymalen Stammzellen in Knorpeldefekte

Bioimaging Methoden zur Zelle Bioverteilung von Nanopartikeln zu beurteilen sind anwendbar für therapeutische und diagnostische Überwachung von nanoformulated Verbindungen. Die hierin beschriebenen Verfahren sind sensitiver und spezifischer als durch histologische Koregistrierung beurteilt. Die Methoden liefern eine translatorische Weg von Nagetieren auf Menschen-Anwendungen.

Registrierte Bioimaging von Nanomaterialien für Diagnostische und Therapeutische Überwachung

Wir beschreiben eine Technik zur Kennzeichnung und Verfolgung von Stammzellen mit FDA-Zulassung, superparamagnetische Eisenoxid (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Diese zellulären bildgebendes Verfahren, das Magnetresonanz-(MR)-Bildgebung nutzt zur Visualisierung, ist leicht zugänglich für die langfristige Überwachung und Diagnose von Erfolg oder Misserfolg Stammzellen engraftments bei Patienten.

Labeling Stammzellen mit Ferumoxytol, eine FDA-Zulassung Eisenoxid-Nanopartikel

Dieser Artikel beschreibt eine optimierte Abfolge der Ereignisse für multimodale Bildgebung von zellulären Transplantaten im Gehirn von Nagetieren mit: (i) In-vivo-Biolumineszenz-und Kernspintomographie, und (ii) post mortem histologische Analyse. Die Kombination dieser bildgebenden Verfahren auf einem einzigen Tier erlaubt zelluläre Transplantat Auswertung mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Spezifität.

Multimodale Bildgebung von Stem Cell Implantation in das zentrale Nervensystem der Mäuse

Verfolgung von Zellen mittels MRT hat bemerkenswerte Aufmerksamkeit in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen. Dieses Protokoll beschreibt die Kennzeichnung von dendritischen Zellen mit Fluor...

Überwachung dendritische Zellen mit Migration<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H Magnetic Resonance Imaging

Protokolldaten werden für in vitro-Markierung humaner embryonaler Stammzellen, die mit der zweiten Harmonischen erzeugenden Nanopartikeln bereitgestellt. Methoden zur Untersuchung von hESC Multi-Photonen-Mikroskopie und deren Differenzierung in Herz Cluster werden ebenfalls vorgestellt.

Harmonic Nanopartikel für Regenerative Forschung

Kombinatorische 5 fluoreszierenden Proteinen markiert von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen in vivo ermöglicht klonalen Tracking über die konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie, die einen Einblick in die Knochenmark blutbild Architektur während der Regeneration. Dieses Verfahren ermöglicht nicht-invasive Abbildung von Schicksal spektral kodierten HSPCs abgeleiteten Zellen in intaktem Gewebe für ausgedehnte Zeiträume nach der Transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

Gezielte Zellverabreichung ist nützlich in einer Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen.  Das Ziel dieses Protokolls ist es, superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel (SPION) zur Markierung von Zellen zu verwenden und dadurch magnetische Zell-Targeting-Ansätze für ein hohes Maß an Kontrolle über die Zellabgabe und -lokalisierung zu ermöglichen.

Zellmarkierung und Targeting mit superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel

Hier wird ein Protokoll zur nicht-invasiven mesenchymalen Stammzell-Entbindung (MSC) und Tracking in einem Mausmodell traumatischer Hirnverletzungen vorgestellt. Superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel werden als Magnetresonanztomographie (MRT) für die MSC-Kennzeichnung und nicht-invasive in vivo-Tracking nach intranasaler Abgabe mittels Echtzeit-MRT eingesetzt.

Verfolgung von superparamagnetischen Eisenoxid-beschrifteten mesenchymalen Stammzellen mit MRT nach intranasaler Lieferung in einem traumatischen Hirnverletzungs-Murine-Modell

Erfahren Sie die Markierung humaner mesenchymaler und embryonaler Stammzellen mit eisenoxidhaltigen Kontrastmitteln für die nicht-invasive MR-Bildgebung in vivo. Diese Methode ermöglicht Forschern die Verfolgung injizierter Zellen zur Evaluierung neuer Stammzelltherapien.

Labeling hESCs und hMSCs mit Eisenoxid-Nanopartikel für Non-Invasive in vivo-Tracking mit MR-Bildgebung

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