Labeling hESCs und hMSCs mit Eisenoxid-Nanopartikel für Non-Invasive in vivo-Tracking mit MR-Bildgebung

Für die Bewertung von neuen Stammzelltherapien ist es wichtig, nicht-invasiv Spur der injizierten Zellen in vivo. Dieses Video zeigt Ihnen, wie Sie humanen mesenchymalen und embryonalen Stammzellen mit Eisenoxid-Kontrastmittel in vivo für die nachfolgenden MR-Bildgebung in vivo-Label.

Willkommen im Labor von Dr. Haiku Dal Link. Wir danken dem California Institute of Regenerative Medicine für die Finanzierung dieses Projekts zur Evaluierung neuer Stammzelltherapien. Es ist wichtig, die injizierten Zellen in vivo nicht-invasiv zu verfolgen.

Dies ist möglich, indem die Zellen in vitro mit spezifischen oder multifunktionalen Kontrastmitteln für die MRT-Bildgebung oder optische Bildgebung markiert werden. In diesem Video erfahren Sie, wie Sie humane mesenchymale und humane embryonale Stammzellen für die anschließende In-vivo-Bildgebung markieren können. Hallo, ich bin Tobias Henning von der Contrast Agent Research Group am Center for Molecular and Functional Imaging in der Abteilung für Radiologie der University of California San Francisco.

Heute zeige ich Ihnen Verfahren zur In-vitro-Markierung von humanen mesenchymalen Stammzellen mit Peric, Caron und von humanen embryonalen Stammzellen mit Phemoxiden. Diese Technik ist nützlich, um injizierte Zellen in vivo zu lokalisieren oder Informationen über ihren Funktionszustand zu erhalten. Die Verfahren für die Zellmarkierung mit MRT-bewusstem Mittel variieren für embryonale und mesenchymale Stammzellen, aber beide Techniken umfassen die folgenden Schritte: Vorbereitung der Zellkultur, die die Beschichtung von Zellen als Klebstoff in Zellkulturen durchführt, Vorbereitung der Markierung, Medienmarkierung der Zellen durch einfache Inkubation von Trypsin von Stammzellen und Abwaschen eines freien bewussten Mittels Bewertung der Markierungseffizienz und Zellviabilität.

Fangen wir also an und beschriften einige Zellen. Beginnen wir nun mit der Markierung mesenchymaler Stammzellen mit Theo Carbatrol. Zunächst werde ich die Technik zur Markierung humaner mesenchymaler Stammzellen mit Theo-Carron und Eisenoxid-basiertem Kontrastmittel für die MR-Bildgebung vorstellen.

Zu Beginn plattieren wir die Zellen 18 bis 24 Stunden vor dem Markierungsverfahren in T 75-Kolben bei einem Zusammenfluss von 80 %. Andernfalls, wenn Sie eine andere Kulturschale verwenden, die am nächsten Tag etwa 10.000 Zellen pro Quadratzentimeter entspricht, beginnen wir mit der Vorbereitung des Markierungsmediums, indem wir 30 Mikroliter Reservist zu acht Millilitern serumfreiem Medium hinzufügen. Dadurch wird ein T 75 FLA mit einer Kofluenz von 80 % markiert, was einer Konzentration von hundert Mikrogramm Eisen pro Milliliter Medium entspricht. Nun nehmen wir die Nährmedien ab und waschen die Zellen einmal mit PBS oder serumfreien Medien.

Wir tun dies, um Reste von Serumproteinen und anderen Bestandteilen des Mediums zu entfernen, die die Kontrastmittel binden und die Markierungseffizienz beeinflussen könnten. Geben Sie das Etikettiermedium in den Kolben und setzen Sie den Kolben wieder in den Inkubator ein. Nach zwei Stunden fügen Sie zwei ml FCS hinzu, so dass eine Endkonzentration von 20 % FCS erreicht wird.

Wir tun dies, um sicherzustellen, dass die Zellen keinen Reiz erhalten, um zu unterscheiden, dass es tot ist, in ihrer vertrauten Umgebung zu wachsen. Nun inkubieren wir die Zellen für 18 Stunden. Am nächsten Tag spülen wir die Zellen mit PBS und gizieren sie dann gemäß den Standardkulturprotokollen, um das freie Kontrastmittel loszuwerden.

Nach der Inaktivierung von Tryps wird die Zellsuspension dreimal gewaschen, indem sie fünf Minuten lang bei 400 RCF zentrifugiert und in PBS reussuspendiert wird. Das wars. Die finale Zelle P kann resuspendiert werden und ist bereit für weitere Experimente.

Wir zählen jetzt die Zellen, da wir bei den vorherigen Waschschritten möglicherweise einige verloren haben. Wir führen an dieser Stelle auch Viabilitätstests mit dem Trippinblau-Ausschluss-Assay durch und entnehmen einige Proben für die spektrometrische Analyse, um die Markierungseffizienz zu messen. Lassen Sie mich Ihnen nun zeigen, wie man menschliche embryonale Stammzellen mit Phemoxiden markiert

Zu Beginn legen wir die menschlichen embryonalen Stammzellen in 10-Zentimeter-Schalen an. Wie üblich sind diese Schalen mit Gelatine vorcodiert und mit bestrahlten Feederzellen versehen. Sie können dieses Protokoll auch für Feeder-freie Kulturen verwenden.

Wir lassen die menschlichen embryonalen Stammzellen etwa drei bis vier Tage lang wachsen und wachsen, so dass sie mittelgroße Kolonien bilden. In dieser Zeit achten wir darauf, dass die Völker nicht zu groß werden, da größere Völker schwieriger aufzubrechen sind. Später können differenzierte Zellen diese Kulturen kontaminieren.

Abhängig von der Sauberkeit der Kolonien kann es also sein, dass wir differenzierte Kulturen durch Sezieren loswerden müssen. Nun bereiten wir das Markierungsmedium vor, das aus Theoremoxiden in einer Konzentration von hundert Mikrogramm Eisen pro Milliliter und vollem humanen embryonalen Stammzellmedium besteht. Dafür mischen wir 89 Mikroliter, Phemoxide und 10 Milliliter Vollwachstumsmedien.

Bei mesenchymalen Stammzellen spülen wir das Geschirr einmal mit einem vollständigen Medium, um abgestorbene Zellen oder Ablagerungen zu entfernen. Dann fügen wir 10 Milliliter Markierungsmedium pro Schale hinzu und inkubieren die Zellen vier Stunden lang. Jetzt ist die Beschriftung abgeschlossen.

Im nächsten Schritt müssen wir die Zellen waschen und eine Einzelzellsuspension erhalten. Zur weiteren Verwendung Spülen wir das Gericht zunächst mit PBS aus. Wir ersetzen nun das PBS durch fünf Milliliter 0,25%iges Trypsin und inkubieren fünf Minuten im Inkubator oder bis sich die Zellen ablösen.

Es hilft, häufig auf die Schale zu klopfen, die Zellen haben sich jetzt gelöst. Denken Sie daran, dass, wenn das Gericht größere Kolonien enthielt, dies einige Klumpen sein könnten, um diese Klumpen loszuwerden. Wir mischen die gesamte Suspension gründlich, indem wir sie mit einer serologischen Pipette auf und ab pipettieren und dann weitere zwei Minuten ruhen lassen.

Im Trypsin. Wir verwenden keine Eppendorf-Pipette, da wiederholtes Pipettieren der Zellen durch die dünne Spitze die Zellmembranen aufbrechen kann, wenn alles richtig funktioniert. Wir haben jetzt eine Einzelzellsuspension, die mit vielen Ablagerungen vermischt ist, die von der Gelatinebeschichtung, der embryonalen Stammzellmatrix und abgestorbenen Zellen stammen.

Wir können nun verbleibende Klumpen oder Komplexe entfernen, indem wir die Zellen durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb führen. Nun gilt es, die menschlichen embryonalen Stammzellen aus den bestrahlten Feederzellen zu isolieren. Dies kann effizient erreicht werden, indem die Zellsuspension auf einer mit Gelatine beschichteten Schale plattiert wird.

Wenn wir die Schale nicht manipulieren, sedimentieren alle Zellen, aber die Futterfresser heften sich schneller an als die menschlichen embryonalen Stammzellen. Wenn wir also das SUP Natin nach 45 Minuten abnehmen, sollte es hauptsächlich menschliche embryonale Stammzellen enthalten, während die Futterhäuschen hauptsächlich an der Schale befestigt sein sollten. Auf diese Weise erhalten wir eine Einzelzellsuspension aus magnetisch markierten humanen embryonalen Stammzellen, die für weitere Experimente wie im vorherigen Protokoll verwendet werden kann.

Zu diesem Zeitpunkt müssen Sie die Zellen zählen und Proben für die Viabilitätsbewertung und die Messung der Markierungseffizienz entnehmen. Damit sind die Protokolle abgeschlossen, die ich Ihnen heute zeigen wollte. Werfen wir nun einen Blick darauf, wie wir markierte Stammzellen in vivo verfolgen können.

Diese Folie zeigt mit OC Carone markierte Stammzellen. Nachdem sie in das Gehirn einer Maus injiziert worden waren, haben wir 20.000 Zellen mit einem Volumen von 75 Nanolitern reanimiert und in die subventrikuläre Zone injiziert. Das Eisenoxid in den implantierten Zellen verursacht ein Suszeptibilitätsartefakt, das im MRT zu sehen ist. Bilder.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie embryonale und mesenchymale Stammzellen markieren können. Die In-vitro-Verfolgung von mesenchymalen und embryonalen Stammzellen in vivo mit Mr.Contrast hat ein enormes Potenzial für die Evaluierung neuer Stammzelltherapien. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei der Zellmarkierung.