Quantifizierung von Violacein in Chromobacterium violaceum und seine Hemmung durch bioaktive Verbindungen

Unsere Forschung zielt darauf ab, Verbindungen zu identifizieren, die das Quorum Sensing hemmen, das wichtige Phänotypen reguliert. Dieses Protokoll untersucht Moleküle, die die Violaceinproduktion reduzieren, ohne das Bakterienwachstum zu beeinflussen, was auf eine Interferenz des Quorum Sensing hindeutet. Jüngste Studien haben neue bioaktive Verbindungen identifiziert, die das Quorum Sensing hemmen, ohne das Bakterienwachstum zu beeinflussen, und so ihr Potenzial als Antivirulenzmittel gegen antibiotikaresistente Bakterien verstärken.

Zu den größten Herausforderungen gehört die Spezifität der Quorum-Sensing-Hemmung, da Verbindungen das Wachstum oder die Merkmale beeinflussen können. In diesem Protokoll, das als Deferenz und Löslichkeit bezeichnet wird, erfordert die Quantifizierung der Auswirkungen eine sorgfältige Handhabung. Wir haben ein Protokoll etabliert, das in bioaktiven Verbindungen in subinhibitorischen Konzentrationen verwendet wird, die das Bakterienwachstum nicht beeinflussen.

Dies ist eine wichtige Prämisse für den Start der Quorum Sensing-Signalgebung, die sich von der antimikrobiellen Forschung unterscheidet. Wir werden uns auf die Identifizierung neuer Quorum-State-Inhibitoren und die Aufklärung von Hemmmechanismen der Kommunikation konzentrieren, insbesondere bei Bakterien, die für Lebensmittel und Gesundheit relevant sind. Züchten Sie zunächst eine Fünf-Milliliter-Kultur von Chromobacterium violaceum ATCC 12472 in Luria Bertani oder LB-Brühe.

Inkubieren Sie die Kultur bei 30 Grad Celsius in einem Schüttelinkubator, der auf 220 Umdrehungen pro Minute eingestellt ist, für 24 Stunden. Messen Sie die optische Dichte der Übernachtkultur und stellen Sie sie auf etwa eins mal 10 hoch acht koloniebildende Einheiten pro Milliliter ein. Mit der LB-Brühe.

Für die Herstellung der Verbindung wiegen Sie die bioaktive Verbindung und verdünnen Sie sie je nach Löslichkeit entweder in reinem DMSO oder einer Eins-zu-Eins-Mischung aus DMSO und Wasser. Nehmen Sie eine 96-Well-Platte mit flachem Boden und fügen Sie LB-Bouillon zusammen mit der bioaktiven Verbindung nach einem seriellen Verdünnungsschema hinzu. Um das erforderliche Volumen der Stammlösung für die gewünschte Konzentration in jeder Vertiefung zu berechnen, wenden Sie die Formel an.

In der ersten Spalte jedes Getreideverdünnungssets. Fügen Sie 196 Mikroliter Luria Bertani-Brühe zu den Spalten drei, fünf und sieben hinzu. Geben Sie dann in den nachfolgenden Säulen, die für die Verdünnung verwendet werden, 100 Mikroliter Luria Bertani-Brühe in die Spalten vier, sechs und acht.

Um die serielle Verdünnung einzuleiten, geben Sie vier Mikroliter der bioaktiven Verbindung in die erste Vertiefung jedes Sets, was den Spalten drei, fünf und sieben entspricht. Übertragen Sie nach dem Mischen 100 Mikroliter aus jeder Vertiefung in die benachbarte Säule. Um die serielle Verdünnung bis zu den Spalten vier, sechs und acht fortzusetzen.

Wiederholen Sie den gesamten Vorgang in dreifacher Ausfertigung für jede Konzentration jeder Verbindung mit frischen Spitzen, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. 80 Mikroliter Luria Bertani Brühe in die Reihen B bis D in alle Vertiefungen geben. Damit steigt die Gesamtmenge auf 180 Mikroliter pro Vertiefung.

Geben Sie dann 20 Mikroliter der standardisierten Chromobacterium violaceum-Kultur aus dem vorherigen Präparat in jede dieser Vertiefungen, um ein Endvolumen von 200 Mikrolitern zu erreichen. Basierend auf der Kompatibilität des Spektralphotometers. Decken Sie die Mikroplatte mit einem Deckel oder einer Siegelfolie ab, um eine Verdunstung zu verhindern.

Inkubieren Sie die versiegelte Platte bei 30 Grad Celsius unter Rühren bei 130 Umdrehungen pro Minute für 24 Stunden. Nach der Inkubation stellen Sie die Platte in einen Trockenbrutschrank, der auf 60 Grad Celsius eingestellt ist. Nehmen Sie den Deckel ab und lassen Sie ihn etwa acht Stunden lang vollständig trocknen.

Nach dem Trocknen nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und geben Sie 200 Mikroliter reines DMSO in jede Vertiefung. Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie sie bei 25 Grad Celsius unter Schütteln bei 130 Umdrehungen pro Minute für 30 Minuten, um das Violacein-Pigment aufzulösen. Übertragen Sie nach der Inkubation vorsichtig 100 Mikroliter der gelösten Violaceinlösung in eine neue Mikrotiterplatte.

Vermeiden Sie den Kontakt zwischen der Pipettenspitze und den Vertiefungswänden. Messen Sie die Absorption von Violacein bei 595 Nanometern in einem Mikrotiterplatten-Spektralphotometer mit aufgesetztem Deckel, um eine Kontamination zu vermeiden. Schütteln Sie vor jeder Messung fünf Sekunden lang und führen Sie die Messung bei aufgesetztem Deckel durch, um eine Kontamination zu vermeiden.

Um die Violacein-Produktion zu berechnen, subtrahieren Sie zunächst die Absorption des Blindwerts von jeder Probe, um Hintergrundinterferenzen auszuschließen, und berechnen Sie dann den Prozentsatz von Violacein unter Verwendung der unbehandelten Kontrolle als Referenz mit der Gleichung. Drei bioaktive Verbindungen, Resveratrol, Farnesol und Linalool, wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die Violaceinproduktion in Chromobacterium violaceum ATCC 12472 zu hemmen. Farnesol reduzierte die Violaceinproduktion signifikant auf 9 % bei 200 Mikrogramm pro Milliliter und auf 19 % bei 100 Mikrogramm pro Milliliter, verglichen mit 100 % bei der unbehandelten Kontrolle.

Die Behandlung mit Linalool mit 200 und 100 Mikrogramm pro Milliliter führte zu einer Violaceinproduktion von 32 %, was eine Hemmung von 68 % im Vergleich zur Kontrolle zeigt. Resveratrol bei 25 Mikrogramm pro Milliliter reduzierte die Violaceinproduktion auf 15 %, während es bei 12 Mikrogramm pro Milliliter 30 % erreichte, verglichen mit 100 % in der unbehandelten Kontrolle. Mikroplatten-Bilder bestätigten visuell eine reduzierte Violacein-Pigmentierung bei allen Behandlungen im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle.