Live-Imaging-Charakterisierung von Zentromerbewegungen während der männlichen meiotischen Prophase in Arabidopsis thaliana

Unsere Forschung untersucht Pflanzenmeiose und zielt darauf ab, molekulare Mechanismen aufzudecken, die die Erkennung, Ausrichtung und Paarung homologer Chromosomen während des meiotischen Fortschreitens steuern. Die Herausforderung besteht darin, die Chromosomenbewegung in meiotischen Profilen zu visualisieren, was eine Live-Gewebebildgebung mit hoher Auflösung und Geschwindigkeit zur Verfolgung von Flugbahnen erfordert. Zu Beginn entferne du die Schutzfolie des Abstandshalters auf einer Seite und platziere sie in die Mitte eines Glasschlittens.

Dann entferne ich die zweite Schutzfolie. Geben Sie acht Mikroliter Leitungswasser in die Mitte des Abstandshalters ab. Mit einer Pinzette wählt man einen Blütenstand aus einem der Hauptstängel.

Setzen Sie den Blütenstand auf einen neuen Objektträger, der unter einem Stereomikroskop mit Lineal positioniert ist. Wählen Sie Blütenknospen aus, die etwa 0,5 Millimeter lang sind. Mit scharfen Nadeln öffnen Sie die Knospen vorsichtig, indem Sie die Kelchblätter und Blütenblätter auseinanderziehen, sodass nur die Staubbeutel erhalten bleiben.

Führen Sie die Mehrbeutelbüschel vorsichtig in das Wasser in der Abstandsraumhöhle um, unmittelbar nach dem Entfernen der Kelchblätter und Blütenblätter, um Austrocknung zu vermeiden. Deponiere mehrere weitere Bündel in der Abstandshalterhöhle. Um den Schlitten mit einem Deckel zu bedecken und Luftblasen zu vermeiden, geben Sie acht Mikroliter Wasser auf einen Deckel.

Dann wenden Sie vorsichtig den Deckelversatz um, sodass der Wassertropfen zur Abstandsraum-Höhle zeigt. Stellen Sie sicher, dass die Antherbündel in insgesamt 16 Mikroliter Wasser eingetaucht sind und dass der Abdecker gut am Abstandshalter haftet. Stellen Sie das Mikroskop auf, indem man GFP bei 488 Nanometern anregt und mit einem Hybriddetektor zwischen 494 und 547 Nanometern detektiert.

Dann lokalisiere den Anther mit Brightfield-Beleuchtung. Mit dem Hellfeldkanal bestimmen Sie das meiotische Stadium anhand der Form der Zellen. Visualisieren Sie den Staubbeutel in der Software und verwenden Sie das RFP-Signal als zusätzlichen Indikator für das meiotische Stadium der Zellen.

Um kontinuierliche Aufnahmen durchzuführen, stellen Sie das Zeitintervall im Zeitabschnitt auf null. Dann nutze das Spot-Modul, um Spots automatisch zu verfolgen. Wählen Sie den grünen Quellkanal und stellen Sie den XY-Durchmesser für das mit GFPCENH3 markierte Centromer auf einen Mikrometer ein.

Dann modifizieren Sie die Erkennungsqualität basierend auf der Signalintensität mit dem Graphen am unteren Rand des Steuerungsfensters. Verwenden Sie den autoregressiven Bewegungsverfolgungsalgorithmus, um Centromer-Trajektorien nachzuzeichnen und alle Trajektorien zu visualisieren, um Meiozyten leicht von somatischen Geweben zu unterscheiden. Als Nächstes verwenden Sie das Spot-Modul, um Spots über die Zeit am ausgewählten Kern zu verfolgen.

Definieren Sie ein Interessengebiet, indem Sie das Optionssegment auswählen, nur ein Interessensgebiet und führen Sie Spot-Tracking innerhalb dieses durch. Wählen Sie ein Interessengebiet aus, das den Kern in allen drei Dimensionen und über die Zeit korrekt umfasst. In einem Linienplot verwenden Sie den 3D-Viewer der Software, um alle Flugbahnen zu visualisieren.

Entferne die Bahnen außerhalb der analysierten Meiozyte, indem du sie auswählst und die Löschtaste auf der Tastatur drückst. Im Bearbeitungsmodus löschen oder fügen Sie ein Objekt hinzu, um sicherzustellen, dass das Objekt in der richtigen Ebene hinzugefügt wird. Im Edit-Tracks-Modus verbinden Sie die neuen Objekte im Lineage-Plot manuell, nachdem Sie die Zelle in 3D gründlich analysiert haben.

Berechnen Sie die momentane Geschwindigkeit bei jedem Zeitschritt, um Variationen der Bewegungsgeschwindigkeit über die Zeit zu überwachen. Berechnen Sie den Wendewinkel als Änderung der Bewegungsrichtung zwischen aufeinanderfolgenden Zeitschritten, um Flugbahnmuster zu erkennen. Speichern Sie das Ergebnis zusammen mit der sofortigen Geschwindigkeit.

Berechnen Sie das Outreach-Verhältnis mit dem Cell Tracker, um zu messen, wie weit sich ein verfolgtes Objekt relativ zu seiner Ausgangsposition bewegt, was auf exploratives Verhalten hinweist. Berechnen Sie die Durchschnittsgeschwindigkeit jeder Strecke, um die Bewegungsmerkmale über den Beobachtungszeitraum zusammenzufassen. Berechnen Sie den durchschnittlichen Wendewinkel pro Strecke, um Bewegung, Richtung und Verhaltensmuster zu analysieren und das Ergebnis zu speichern.

Als Nächstes wird die Schwerpunktgröße bei jedem Zeitschritt berechnet, um die räumliche Streuung der Zentromere um ihre durchschnittliche Position zu messen. Verwenden Sie Variationen in der Schwerpunktgröße über die Zeit hinweg, um globale Konsistenz zwischen den Centromerspuren zu bewerten und das Ergebnis zu speichern. Berechnen Sie die Geschwindigkeitskreuzkorrelation, um die Beziehungen zwischen den Bewegungsdynamiken verschiedener verfolgter Objekte zu analysieren, die potenzielle koordinierte Verhaltensweisen offenbaren.

Berechnen Sie dann die mittlere quadratische Verschiebung jeder Strecke, um die durchschnittliche quadratische Distanz von Zentromeren über einen bestimmten Zeitraum zu quantifizieren. Meiotische Zentromere wiesen eine signifikant höhere Durchschnittsgeschwindigkeit von 109,35 Nanometern pro Sekunde auf im Vergleich zu somatischen Zentromeren. Meiotische Zentromere zeigten ein breiteres Spektrum und ein höheres normalisiertes Reichweitenverhältnis im Vergleich zu somatischen Zentromeren.

Die Verteilung des Wendewinkels unterschied sich zwischen meiotischen und somatischen Zentromeren. Die mittlere quadratische Verschiebung meiotischer Zentromere nahm im Laufe der Zeit zu, während die somatischen Zentromere weitgehend unverändert blieben. Dieses Protokoll ermöglichte die erstmalige Quantifizierung der meiotischen Chromosomenbewegung in Arabidopsis und zeigte dramatische Dynamik der Zentromere während der Zygoten- und Pachytenphase.

Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung der Bewegungen der genomischen Region während der meiotischen Prophase und kann für die Anwendung in anderen Pflanzenarten angepasst werden. Diese Arbeit ermöglicht die Erforschung der Chromosomenbewegung und des Zusammenspiels der Rekombination und vertieft das Verständnis der Mechanismen, die die genetische Vielfalt während der Pflanzengametenbildung steuern.