Name: Überexpression und Reinigung einer toxischen Nuklease aus Escherichia coli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Lernen Sie die Überexpression und Reinigung der toxischen Nuklease Nsp15 aus Escherichia coli mithilfe von Affinitäts- und Größenausschlusschromatographie. Diese Methode ermöglicht biochemische und strukturelle Studien.

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<ol><li>Francis, D. M., Page, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+optimize+protein+expression+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Strategies to optimize protein expression in E. coli.</a> Curr Protoc Protein Sci. 61 (1), 5.24.1-5.24.29 (2010).</li>
<li>Dumon-Seignovert, L., Cariot, G., Vuillard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+toxicity+of+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli%3A+a+comparison+of+overexpression+in+BL21%28DE3%29%2C+C41%28DE3%29%2C+and+C43%28DE3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of overexpression in BL21(DE3), C41(DE3), and C43(DE3).</a> Protein Expr Purif. 37 (1), 203-206 (2004).</li>
<li>Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli%3A+advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges.</a> Front Microbiol. 5, 1-17 (2014).</li>
<li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+Escherichia+coli+for+membrane+protein+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14371-14376 (2008).</li>
<li>Kato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extremely+low+leakage+expression+systems+using+dual+transcriptional-translational+control+for+toxic+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Extremely low leakage expression systems using dual transcriptional-translational control for toxic protein production.</a> Int J Mol Sci. 21 (3), 705(2020).</li>
<li>Dubendorf, J. W., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+basal+expression+in+an+inducible+T7+expression+system+by+blocking+the+target+T7+promoter+with+lac+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor.</a> J Mol Biol. 219 (1), 45-59 (1991).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bacteriophage+T7+lysozyme+to+improve+an+inducible+T7+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of bacteriophage T7 lysozyme to improve an inducible T7 expression system.</a> J Mol Biol. 219 (1), 37-44 (1991).</li>
<li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli%3A+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> J Mol Biol. 260 (3), 289-298 (1996).</li>
<li>Schlegel, S., Genevaux, P., de Gier, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De-convoluting+the+genetic+adaptations+of+E.+coli+C41%28DE3%29+in+real+time+reveals+how+alleviating+protein+production+stress+improves+yields%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">De-convoluting the genetic adaptations of E. coli C41(DE3) in real time reveals how alleviating protein production stress improves yields.</a> Cell Rep. 10 (10), 1758-1766 (2015).</li>
<li>James, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+over-expression+in+Escherichia+coli+triggers+adaptation+analogous+to+antimicrobial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Protein over-expression in Escherichia coli triggers adaptation analogous to antimicrobial resistance.</a> Microb Cell Fact. 20 (1), 13(2021).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dimerization-dependent+mechanism+drives+the+endoribonuclease+function+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+nsp11%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A dimerization-dependent mechanism drives the endoribonuclease function of porcine reproductive and respiratory syndrome virus nsp11.</a> J Virol. 90 (9), 4579-4592 (2016).</li>
<li>Nedialkova, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+arterivirus+nonstructural+protein+11+reveals+the+nidovirus-wide+conservation+of+a+replicative+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of arterivirus nonstructural protein 11 reveals the nidovirus-wide conservation of a replicative endoribonuclease.</a> J Virol. 83 (11), 5671-5682 (2009).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronavirus+endoribonuclease+ensures+efficient+viral+replication+and+prevents+protein+kinase+R+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Coronavirus endoribonuclease ensures efficient viral replication and prevents protein kinase R activation.</a> J Virol. 95 (7), e02103-e02120 (2021).</li>
<li>Joseph, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+monomeric+form+of+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+endonuclease+nsp15+suggests+a+role+for+hexamerization+as+an+allosteric+switch%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a monomeric form of severe acute respiratory syndrome coronavirus endonuclease nsp15 suggests a role for hexamerization as an allosteric switch.</a> J Virol. 81 (12), 6700-6708 (2007).</li>
<li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+for+endoribonuclease+nsp15-mediated+regulation+of+alpha-coronavirus+propagation+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Diversity for endoribonuclease nsp15-mediated regulation of alpha-coronavirus propagation and virulence.</a> Microbiol Spectr. 11 (6), e02209-e02223 (2023).</li>
<li>Guarino, L. A., Bhardwaj, K., Dong, W., Sun, J., Holzenburg, A., Kao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+SARS+virus+nsp15+endoribonuclease%3A+identification+of+residues+affecting+hexamer+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the SARS virus nsp15 endoribonuclease: identification of residues affecting hexamer formation.</a> J Mol Biol. 353 (5), 1106-1117 (2005).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+antiviral+target+revealed+by+the+hexameric+structure+of+mouse+hepatitis+virus+nonstructural+protein+nsp15%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">New antiviral target revealed by the hexameric structure of mouse hepatitis virus nonstructural protein nsp15.</a> J Virol. 80 (16), 7909-7917 (2006).</li>
<li>Bhardwaj, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+analyses+of+the+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+endoribonuclease+nsp15%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural and functional analyses of the severe acute respiratory syndrome coronavirus endoribonuclease nsp15.</a> J Biol Chem. 283 (6), 3655-3664 (2008).</li>
<li>Pillon, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+of+the+SARS-CoV-2+endoribonuclease+nsp15+reveal+insight+into+nuclease+specificity+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures of the SARS-CoV-2 endoribonuclease nsp15 reveal insight into nuclease specificity and dynamics.</a> Nat Commun. 12 (1), 636(2021).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+nsp15+endoribonuclease+NendoU+from+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of nsp15 endoribonuclease NendoU from SARS-CoV-2.</a> Protein Sci. 29 (7), 1596-1605 (2020).</li>
<li>Chaga, G., Hopp, J., Nelson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+metal+ion+affinity+chromatography+on+Co2%2B+carboxymethylaspartate-agarose+Superflow%2C+as+demonstrated+by+one-step+purification+of+lactate+dehydrogenase+from+chicken+breast+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Appl+Biochem%22%5BJournal%5D)">Immobilized metal ion affinity chromatography on Co2+ carboxymethylaspartate-agarose Superflow, as demonstrated by one-step purification of lactate dehydrogenase from chicken breast muscle.</a> Biotechnol Appl Biochem. 29 (1), 19-24 (1999).</li>
<li>Cao, J., Wu, C. C., Lin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turkey+coronavirus+non-structure+protein+NSP15+-+an+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Turkey coronavirus non-structure protein NSP15 - an endoribonuclease.</a> Intervirology. 51 (5), 342-351 (2008).</li>
<li>Andersen, K. R., Leksa, N. C., Schwartz, T. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+E.+coli+expression+strain+LOBSTR+eliminates+common+contaminants+from+His-tag+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Optimized E. coli expression strain LOBSTR eliminates common contaminants from His-tag purification.</a> Proteins. 81 (11), 1857-1861 (2013).</li>
<li>Saida, F., Uzan, M., Odaert, B., Bontems, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+highly+toxic+genes+in+E.+coli%3A+special+strategies+and+genetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protein+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression of highly toxic genes in E. coli: special strategies and genetic tools.</a> Curr Protein Pept Sci. 7 (1), 47-56 (2006).</li>
<li>Godoy, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+regulation+and+crystallographic+fragment+screening+of+SARS-CoV-2+nsp15+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Allosteric regulation and crystallographic fragment screening of SARS-CoV-2 nsp15 endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 51 (10), 5255-5270 (2023).</li>
<li>Otter, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+nsp15+endoribonuclease+antagonizes+dsRNA-induced+antiviral+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 nsp15 endoribonuclease antagonizes dsRNA-induced antiviral signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (15), e2320194121(2024).</li>
<li>Wang, X., Zhu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+nsp15+preferentially+degrades+AU-rich+dsRNA+via+its+dsRNA+nickase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 nsp15 preferentially degrades AU-rich dsRNA via its dsRNA nickase activity.</a> Nucleic Acids Res. 52 (9), 5257-5272 (2024).</li>
<li>Zheng, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+evolution+of+nidovirus+endoribonuclease+based+on+the+finding+that+nsp15+from+porcine+deltacoronavirus+functions+as+a+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Insight into the evolution of nidovirus endoribonuclease based on the finding that nsp15 from porcine deltacoronavirus functions as a dimer.</a> J Biol Chem. 293 (31), 12054-12067 (2018).</li>
<li>Huang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+RNA+cleavage+by+coronavirus+nsp15+endonuclease%3A+evidence+for+acid-base+catalysis+and+substrate-dependent+metal+ion+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of RNA cleavage by coronavirus nsp15 endonuclease: evidence for acid-base catalysis and substrate-dependent metal ion activation.</a> J Biol Chem. 299 (6), 104787(2023).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+biochemical+characterization+of+endoribonuclease+nsp15+encoded+by+Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural and biochemical characterization of endoribonuclease nsp15 encoded by Middle East respiratory syndrome coronavirus.</a> J Virol. 92 (22), e00893-e00918 (2018).</li>
<li>Jernigan, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+structural+studies+of+SARS-CoV-2+protein+NendoU+with+an+X-ray+free-electron+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Room-temperature structural studies of SARS-CoV-2 protein NendoU with an X-ray free-electron laser.</a> Structure. 31 (2), 138-151.e5 (2023).</li>
<li>Ricagno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+nsp15+from+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of nsp15 from SARS coronavirus.</a> Acta Crystallogr F Struct Biol Cryst Commun. 62 (4), 409-411 (2006).</li>
<li>Canal, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+SARS-CoV-2+antiviral+compounds+by+screening+for+small+molecule+inhibitors+of+nsp15+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Identifying SARS-CoV-2 antiviral compounds by screening for small molecule inhibitors of nsp15 endoribonuclease.</a> Biochem J. 478 (13), 2465-2479 (2021).</li>
<li>Bhardwaj, K., Guarino, L., Kao, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+nsp15+protein+is+an+endoribonuclease+that+prefers+manganese+as+a+cofactor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The severe acute respiratory syndrome coronavirus nsp15 protein is an endoribonuclease that prefers manganese as a cofactor.</a> J Virol. 78 (22), 12218-12224 (2004).</li>
<li>De Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+successful+recombinant+expression+of+disulfide+bond-dependent+proteins+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell+Fact%22%5BJournal%5D)">Strategies for successful recombinant expression of disulfide bond-dependent proteins in Escherichia coli.</a> Microb Cell Fact. 8 (1), 26(2009).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,22 &Mikro; m PES, Sterilisierend, Geringe Proteinbindung, Filtersystem, 1 L</td><td>Corning</td><td>431098</td><td></td></tr><tr><td>AEBSF Serin-Protease-Inhibitor</td><td>Goldbio</td><td>30827-99-7</td><td></td></tr><tr><td>Agar, bakteriologisch</td><td>Amresco</td><td>Nr. J637</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA go Reinigungssystem</td><td>Cytiva</td><td>29383015</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 mL, 30 kDa MWCO-Konzentrator</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin-Natrium</td><td>Goldbio</td><td>Nr. A-301-25</td><td></td></tr><tr><td>Schüttelkolben mit Leitwänden</td><td>Nalgene&nbsp;</td><td>Nr. F0527</td><td></td></tr><tr><td>Tisch-Zentrifuge</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5920R</td><td></td></tr><tr><td>BioPhotometer plus</td><td>Eppendorf</td><td>E-BP6132</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin vom Rind</td><td>BioPharm</td><td>91-030</td><td></td></tr><tr><td>Bradford-Farbstoff-Reagenz</td><td>Boston BioProducts</td><td>BPA-200</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114931</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. C4901</td><td></td></tr><tr><td>Digitales Trockenbad</td><td>Bio Rad</td><td>1660562</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Streuer, L-förmig</td><td>MedSupply Partner</td><td>62-1014-1</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Goldbio</td><td>27565-41-9</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI aus der Bauchspeicheldrüse des Rindes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. D4527</td><td></td></tr><tr><td>Douce Tissue-Schleifmaschine, 40 mL</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Säulen-Chromagtographie-Säulen</td><td>Bio-Rad</td><td>737-1532</td><td></td></tr><tr><td>Enduro Minimix Nutmischer</td><td>Labnet</td><td>Nr. S0600</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Excella E25R Inc/Ref Schüttler</td><td>Eppendorf</td><td>NB-E25R</td><td></td></tr><tr><td>FastPette V2</td><td>Labnet</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite F10-4x1000 LEX Festwinkelrotor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>096-041075</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite F21-8x50y Bremsscheibe mit festem Winkel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>096-084275</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc EZ Imager</td><td>Bio-Rad</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma-Alrich</td><td>Nr. G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. H3375</td><td></td></tr><tr><td>Rührer mit Heizplatte</td><td>VWR</td><td>12365-346</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>VWR</td><td>BDH3028</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Goldbio</td><td>I-902-25</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl-&szlig;-D-Thiogalactiosid (IPTG)</td><td>Goldbio</td><td>Artikel-Nr.: 12481C25</td><td></td></tr><tr><td>Lemo21(DE3) kompetente E. coli-Zellen</td><td>Neuengland Biolabore</td><td>Nr. C2528J</td><td></td></tr><tr><td>Mangan(II)-chlorid-Tetrahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. M3634</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen, 0,5 mL</td><td>VWR</td><td>87003-290</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen, 1,7 mL</td><td>MedSupply Partner</td><td>15-1151</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen, 2 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra vertikale Elektrophoresezelle</td><td>Bio-Rad</td><td>10025025</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean Tris-Glycin-Gele, 4-20%</td><td>Bio-Rad</td><td>4568094</td><td></td></tr><tr><td>MyFuge Mini-Zentruge</td><td>MedSupply Partner</td><td>Nr. C1008-B</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 1 L Super-Speed-Zentrifugenflasche</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3141-1006</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Zentrifugenröhrchen aus Eichenkamm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31139-0050</td><td></td></tr><tr><td>Nanophotometer</td><td>Implen</td><td>3769</td><td></td></tr><tr><td>Wackelfreier Inkubator</td><td>Labnet</td><td>I 5110&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Overexpress C41(DE3) chemisch kompetente Zellen</td><td>Biosearch-Technologien</td><td>60442-1</td><td></td></tr><tr><td>Overexpress C41(DE3) chemisch kompetente Zellen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CMC0017</td><td>Unterbrochen; Biosearch C41(DE3)-Zellen oder NEB Lemo21-Zellen sind eine Alternative</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>MedSupply Partner</td><td>62-1077-3</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide (pET-14b-Rückgrat)</td><td>Genscript (Englisch)</td><td>Sonderanfertigung</td><td></td></tr><tr><td>Mikroküvetten aus Kunststoff</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955127</td><td></td></tr><tr><td>PowerPacuniversal Netzteil</td><td>Bio-Rad</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>Präzisions-Gleitnadel</td><td>Becton Dixon</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>Präzision plus proteinungefärbte Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>1610363</td><td></td></tr><tr><td>Rückgewinnungsmedium für die Äußerung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CMR0001K</td><td></td></tr><tr><td>S-4x1000 schwingender Schaufelrotor</td><td>Eppendorf</td><td>EP-S4X1</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipette, 10 mL</td><td>Faclon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipette, 25 mL</td><td>Faclon</td><td>35725</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipette, 5 mL</td><td>Faclon</td><td>35743</td><td></td></tr><tr><td>Serologische Pipette, 50 mL</td><td>Pr1ma</td><td>PR-Sero-50</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. S9888</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. L3771</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>Schall-Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB505</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Lynx 4000 Zentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75006580</td><td></td></tr><tr><td>Spephadex G-25 M PD-10 Säule</td><td>Cytiva</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-Mercaptoethanol</td><td>Millipore</td><td>444203</td><td></td></tr><tr><td>Griffin-Becher aus Edelstahl</td><td>Polar Ware</td><td>Artikel-Nr.: 13977-010-EA</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Falcon Röhrchen, 15 mL</td><td>Falke</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Falcon Röhrchen, 50 mL</td><td>Falke</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL Säule</td><td>Cytiva</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Spritzen, 1 mL</td><td>Luft-Tite&nbsp;</td><td>A1</td><td></td></tr><tr><td>Spritzen, 3 mL</td><td>Becton Dixon</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>TALON Metall-Affinitätsharz</td><td>Takara</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>Zahnstocher</td><td>Straße der Kreativität</td><td>PAC3690-01</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Basis</td><td>Goldbio</td><td>T-400-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MP Biomedizin</td><td>807423</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Forschungsprodukte International</td><td>Nr. T60065</td><td></td></tr><tr><td>Vornado</td><td>Benchmark</td><td>BV101-G</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Forschungsprodukte International</td><td>Jahr20025</td><td></td></tr></tbody></table>

Überexpression und reinigung einer toxischen nuklease aus escherichia coli

Overexpressing and Purifying a Toxic Nuclease from Escherichia coli

Aufgrund der Toxizität von Nsp15 als Nuklease wurden in der Regel insgesamt ~7 h benötigt, bis die Starterkulturen einen OD600 von 0,8-1,0 erreichten. Nach der Inokulation waren in der Regel insgesamt ~3-5 h für den gleichen optimalen OD600 von 0,8-1,0 für die Induktion erforderlich. In diesem Fall schien die Verdopplungszeit ~1 h zu betragen. Wenn eine katalytisch-tote Mutante von Nsp15 exprimiert wurde, schien die Verdopplung für die E. coli-Zellen normal zu sein (~20 min), ein weiterer B...

Überexpression und Reinigung einer toxischen Nuklease aus Escherichia coli

Escherichia coli has been widely employed as an expression system to produce recombinant proteins. Yet some types of recombinant proteins, such as ...

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Protein Transduktion ermöglicht die direkte Abgabe von biologisch aktiven Proteinen in Zellen. Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden wie DNA-Transfektion oder virale Transduktion dieser nicht-invasiven Paradigma ermöglicht hoch effiziente zelluläre Manipulation in eine titrierbare Weise umgehen zelluläre Toxizität und das Risiko der onkogenen Transformation durch permanente genetische Veränderung.

Engineering zellpermeablen Protein

Systematische, groß angelegte synthetische genetische (Gen-Gen-oder Epistase) Interaktion Bildschirme können verwendet werden, um genetische Redundanz und Weg cross-talk zu erkunden. Hier haben wir eine High-Throughput-quantitative synthetischen genetischen array Screening-Technologie beschreiben, bezeichnet ESGA dass wir für die Aufklärung epistatische Beziehungen und erforschen genetische Interaktion Netze in den...

Mapping Bakterielle Functional Netzwerke und Pathways in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Verwendung von Synthetic Genetic Arrays

Exonukleasen spielen eine entscheidende Rolle bei der Gewährleistung der Genomstabilität. Der Verlust der WRN-Exonuklease-Funktion führt zu vorzeitiger Alterung. Die Untersuchung von Substraten und anderen Anforderungen an die Nuklease in vitro kann helfen, ihre Rolle in vivo aufzuklären. Hier demonstrieren wir einen schnellen und reproduzierbaren fluoreszenzbasierten Assay zur Messung seiner Nukleaseaktivität.

Ein Fluoreszenz-basierte Exonuklease Assay zu DmWRNexo, Ortholog der Menschen Progeroid WRN Exonuclease, und ihre Anwendung auf andere Nukleasen Charakterisieren

Das Fünf-Tage-Protokoll beschreibt alle Schritte, Geräte und Zusatzsoftware notwendig für die Schaffung und den Betrieb einer effizienten endogenen Escherichia coli basierten TX-TL zellfreien Expressionssystem von Grund auf neu. Mit Reagenzien, nimmt das Protokoll 8 Stunden oder weniger, um das Setup eine Reaktion, sammeln und Prozessdaten.

Protokolle für die Implementierung einer Escherichia coli Basierend TX-TL Zellfreie Expression System für Synthetische Biologie

Die Protein-Co-Expression ist eine leistungsstarke Alternative zur Rekonstitution von Proteinkomplexen in vitro und hilft bei der Durchführung biochemischer und genetischer Tests in vivo. In diesem Artikel berichten wir über die Verwendung der Protein-Co-Expression in Escherichia coli, um Proteinkomplexe zu erhalten und die Mutationshäufigkeit von Zellen zu optimieren.

Die vielfältigen Vorteile von Protein Co-expression in<em&gt; Escherichia coli</em

Eine hohe Ausbeute Verfahren zur einstufigen negativen Reinigung von rekombinanten Helicobacter pylori in Escherichia coli Neutrophile aktivierendes durch Verwendung Diethylaminoethyl Harze im Batch - Modus überexprimiert Protein (HP-NAP) beschrieben ist. HP-NAP durch dieses Verfahren gereinigt ist vorteilhaft für die Entwicklung von Impfstoffen, Medikamente oder Diagnostika für H. pylori -assoziierte Krankheiten.

Ein-Schritt-Negative chromatographischer Reinigung von<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrophil-aktivierendes Protein überexprimiert in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Im Batch-Modus

Ein einfaches Protokoll zur Überexpression und Reinigung von codonoptimierter, menschlicher cis- Prenyltransferase unter nicht-denaturierenden Bedingungen aus Escherichia   Coli , wird zusammen mit einem enzymatischen Aktivitäts-Assay beschrieben. Dieses Protokoll kann für die Produktion von anderen cis- Prenyltransferase- Proteinen in Quantität und Qualität geeignet für mechanistische Studien verallgemeinert werden.

Überexpression und Reinigung des Menschen Cis -prenyltransferase in Escherichia coli

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Verwendung von bereits bestehenden antibiotische Resistenz-Kassette Löschung Konstrukte als Grundlage für die Herstellung von Löschung Mutanten in anderen E. Coli -Stämme. Solche Löschung Mutationen können mobilisiert und in den entsprechenden Locus eines Empfängers Stamm mit P1 Bakteriophagen Transduktion eingefügt.

Herstellung von Gen-Deletionen in Escherichia coli durch P1 Transduktion mit verbrauchsteuerpflichtigen Antibiotikaresistenz Kassetten

Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) kann mit seinem Substrat Protocatechuic Säure (PCA) enzymatisch freien diatomischen Sauerstoff aus einem wässrigen System entfernen. Dieses Protokoll beschreibt die Expressions-, Reinigungs- und Aktivitätsanalyse dieses Sauerstoff-Aufräumenzyms.

Expression und Reinigung von Nuklease-freier Sauerstofffänger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Restriktionsendonukleasen mit neuer Sequenzspezifität können aus Enzymen entwickelt werden, die eine teilweise degenerierte Sequenz erkennen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das wir erfolgreich verwendet haben, um die Sequenzspezifität des NlaIV-Enzyms zu verändern. Wesentliche Bestandteile des Protokolls sind die In-vitro-Kompartimentisierung der Transkriptions-/Übersetzungsreaktion und die Auswahl von Varianten mit neuen Sequenzspezifitäten.

In Vitro gerichtete Evolution einer Restriktionsendonuklease mit strengerer Spezifität

Bakterien sezernieren nanometergroße extrazelluläre Vesikel (EVs), die bioaktive biologische Moleküle tragen. Die EV-Forschung konzentriert sich auf das Verständnis ihrer Biogenese, ihrer Rolle bei Mikroben-Mikroben- und Wirt-Mikroben-Interaktionen und Krankheiten sowie ihrer potenziellen therapeutischen Anwendungen. Ein Workflow für die skalierbare Isolierung von EVs aus verschiedenen Bakterien wird vorgestellt, um die Standardisierung der EV-Forschung zu erleichtern.

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

Lernen Sie die Überexpression und Reinigung der toxischen Nuklease Nsp15 aus Escherichia coli mithilfe von Affinitäts- und Größenausschlusschromatographie. Diese Methode ermöglicht biochemische und strukturelle Studien.

Überexpression und Reinigung einer toxischen Nuklease aus Escherichia coli

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