Extraktion von Histonen aus klinischen Proben für epigenetische Profilierung mittels Massenspektrometrie

Der Umfang unserer Forschung besteht darin, epigenetische Veränderungen in Krebsproben zu analysieren, neue diagnostische und prognostische Biomarker zu entdecken und potenzielle Therapieziele zu identifizieren. Eine große Herausforderung bei klinischen Proben ist das begrenzte Material und die durch Fixation induzierten Artefakte. Mit unserem optimierten Arbeitsablauf und der DI-Sensitivität können wir jedoch bis zu 50 Histon-PTMs aus nur 1000 Zellen quantifizieren.

Wir zeigen, dass Massenspektrometrie Histon-PTM-Veränderungen in klinischer Probe quantifizieren kann, was Einblicke in den epigenetischen Mechanismus bietet und die Entdeckung von Biomarkern sowie die Identifizierung von Arzneimittelzielen für präzise epigenetische Therapien ermöglicht. Unser Protokoll berücksichtigt die Notwendigkeit einer robusten, quantitativen und sensiblen Profilierung von Histon-PTM in verschiedenen klinischen Proben. Massenspektrometrie ist ideal für die Histon-PTM-Analyse, da sie eine unvoreingenommene Detektion, gleichzeitiges Profilieren und Ko-Auftreten auf demselben Peptid bietet und so die Einschränkungen antikörperbasierter Methoden überwindet.

Zu Beginn tauen Sie das frisch gefrorene Gewebe auf Eis auf und schneiden Sie mit einem Skalpell oder einer Klinge ein Stück von etwa 20 bis 30 Milligramm, das etwa zwei Kubikmillimetern Gewebe entspricht. Übertragen Sie die geschnittene Gewebeprobe in ein 1,5-Milliliter-Rohr. Mit einer Schere hacken Sie das Gewebe in kleine Stücke.

Gib einen Milliliter frisch vorbereiteten Nukleus-Isolationspuffer mit den angegebenen Proteaseinhibitoren hinzu und zerkleinere das Gewebe erneut. Übertragen Sie die Probe in einen Abwärtshomogenisierer. Mit dem losen Stößel zuerst und dann dem festen Stößel homogenisieren Sie das Gewebe, bis mit bloßem Auge keine sichtbaren Stücke mehr übrig sind.

Filtern Sie die homogenisierte Probe durch ein 100-Mikrometer-Sieb, um Gewebereste zu entfernen. Pipettieren Sie die gefilterte Probe kräftig auf und ab mit einer 200-Mikroliter-Pipette zur Auflösung der Plasmamembran. Übertragen Sie die Probe in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Setzen Sie das Rohr in eine Zentrifuge auf der Werkbank und drehen Sie es mit 2.300 G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius, um die Kerne zu pelletieren. Nach dem Entsorgen des Supernatants wird das Kernpellet in 50 bis 100 Mikrolitern Kernisolierungspuffer wieder suspendiert, ergänzt mit 0,1 % SDS, um die Kernmembran aufzulösen. Anschließend werden 250 Einheiten Benzonase-Nuklease zur resuspendierten Probe gegeben, um Nukleinsäuren zu verdauen.

Gut mischen und zwei Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Für optimale Schneidetemperatur bei gefrorenen Proben waschen Sie das Gewebe mit Ethanolwasser und PBS vor dem Hacken und der Histon-Extraktion. Fügen Sie der FFPE-Probe einen Milliliter Paraffinlösungsmittel hinzu, das in einem 1,5-Milliliter-Rohr entnommen wird, und wirbelt mit maximaler Geschwindigkeit für 30 Sekunden, bis das Paraffin vollständig gelöst ist.

Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 G für drei Minuten bei Raumtemperatur und entsorgen Sie das Supernatant vorsichtig mit einer Pipette mit einer kleinen Spitze, wobei das Pellet vermieden wird. Gib nun einen Milliliter 95%-Ethanol zum Pellet und wirbe mit maximaler Geschwindigkeit 30 Sekunden lang. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 G für drei Minuten bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Supernatanten.

Nach dem Rehydratieren der Probe geben Sie 200 Mikroliter Extraktionspuffer zum Pellet. Homogenisieren Sie das Gewebe im Extraktionspuffer, indem Sie mit einem digitalen Signifikanten mit einer drei Millimeter großen Mikrospitze fornikieren. Nach der Homogenisierung wird die Probe in einem Thermomischer inkubiert und kurz der Rohrdeckel geöffnet, damit das Formaldehyd verdampft.

Nach der Zentrifugation der Probe wird der Überstandsstoff in ein neues, beschriftetes Rohr übertragen. Entfernen Sie die Gelbänder, die dem Molekulargewicht von Kern-Histonproteinen zwischen 10 und 18 Kilodalton entsprechen, mit einem Skalpell. Nach dem Schneiden der Gelbänder verwenden Sie mit demselben Skalpell, um die geschnittenen Gelstücke in ein 1,5-Milliliter-Rohr zu übertragen.

Um das Gel zu entfärben, geben Sie eine Lösung aus 50 % Acetonitril in doppelt destilliertem Wasser und inkubieren Sie das Rohr in einem Thermomixer mit 1.400 Umdrehungen pro Minute für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Trockne die Gelstücke, indem du 100 % Acetonitril hinzufügst. Mischen Sie im Thermomixer bei 1.400 Umdrehungen pro Minute für 10 Minuten bei Zimmertemperatur.

Nach dem Entsorgen des Überstandsmittels trocknen Sie die Gelstücke fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in einer Vakuumzentrifuge. Als Nächstes geben Sie 15 Mikroliter 7,7 Molarproponicanhydrid-Lösung und 26 Mikroliter ein molares Ammoniumbicarbonat zu jedem Rohr und inkubieren. Anschließend wird die Probe mit 80 Mikrolitern eines molaren Ammoniumbicarbonats inkubiert.

Waschen Sie die Gelstücke dann dreimal mit doppelt destilliertem Wasser und entsorgen Sie die Flüssigkeit nach jeder Inkubation. Als Nächstes fügen Sie den Gelstücken 50 % Acetonnitril hinzu und inkubieren Sie bei 1.400 Umdrehungen pro Minute 15 Minuten lang bei Zimmertemperatur. Dann gibt es 100 % Acetonitril, um die Gelstücke vollständig zu dehydrieren.

Inkubieren Sie im Thermomixer mit 1.400 Umdrehungen pro Minute für 15 Minuten bei Zimmertemperatur. Nach dem Entsorgen der Flüssigkeit trocknen Sie die Gelstücke fünf Minuten lang bei Raumtemperatur in einer Vakuumzentrifuge. Geben Sie vier Mikroliter Trypsinlösung und 20 Mikroliter Verdauungspuffer zu jedem Rohr mit Gelstücken.

Inkubieren Sie die Röhrchen 10 Minuten auf Eis, damit Trypsin in das Gel aufgenommen wird. Sobald das Trypsin vollständig aufgenommen ist, gib 80 Mikroliter Verdauungspuffer dazu, um die Gelstücke vollständig zu bedecken, und brüte die Röhren über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Thermomixer. Um die verdauten Peptide zu extrahieren, geben Sie 100 Mikroliter 100 % Acetonitril zu jedem Rohr und inkubieren Sie mit 1.400 Umdrehungen pro Minute für 20 Minuten bei Raumtemperatur in einem Thermomixer.

Sammeln Sie nun vorsichtig das Supernatant ein und geben Sie es in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr. Nach der Wiederholung der Aceto-Nitro-Extraktion mit dem restlichen Gel sammeln Sie die Supernatantien. Konzentrieren Sie die gesammelten Peptide in einer Vakuumzentrifuge, bis das Volumen zwischen einem und fünf Mikrolitern liegt.

Dann fügen Sie zwei Mikroliter ein molares Triethylammoniumbicarbonat und drei Mikroliter Phenylisocyanatlösung hinzu. Inkubieren Sie die Probe mit 350 Umdrehungen pro Minute für 90 Minuten bei 37 Grad Celsius in einem Thermomixer. Um die Derivitisierung zu stoppen, geben Sie acht Mikroliter 1%-Trichloressigsäure zu jedem Rohr hinzu.

Schließlich verdünnen Sie jede Probe, indem Sie 100 Mikroliter Puffer A hinzufügen, und laden die verdünnten Proben auf C18-Stufenspitzen zur Elution. Die Histonextraktion wurde erfolgreich aus frisch gefrorenen, OCT-gefrorenen und FFPE-Proben durchgeführt, wobei unterschiedliche Verarbeitungsabläufe für jeden Gewebetyp verwendet wurden. Trotz geringerer Anreicherung und Hintergrundproteinanwesenheit wurden Histon H3, H2A, H2B und H4 erfolgreich aus FFPE-Proben extrahiert, wie die Bänder in den Lanes FFPE1 und FFPE2 zeigen, was mit etwa einem Mikrogramm des H3.1-Standards übereinstimmt.

Nanoflüssigchromatographie und MS-Analyse von FFPE-abgeleiteten Histonen zeigten eine erfolgreiche Trennung der Histonpeptide über einen 55-minütigen Gradienten mit klaren Retentionszeitspitzen im Gesamtionenchromatogramm. Extrahierte Ionenchromatogramme bestätigten den Nachweis und die Quantifizierung unmodifizierter und methylierter Formen von H3 K vier mit separaten Elutionsprofilen für jeden M-mal-Z-Wert. Ermöglicht die Berechnung der prozentualen relativen Häufigkeit für jede Modifikation.

Die vergleichende Analyse von Histonmodifikationen zwischen normalen und Tumorproben zeigte signifikante Zunahmen bestimmter Typen und eine Abnahme anderer Typen im Tumorgewebe.