Verwendung von LEXY- und LINuS-Optogenetik-Tools und automatisierter Bildanalyse zur Quantifizierung der nukleozytoplasmatischen Transportdynamik in lebenden Zellen

Unser Labor untersucht das Zusammenspiel zwischen den Kernporen und der Chromatinorganisation. Wir untersuchen also, wie die Kernporen die Chromatinorganisation beeinflussen, aber auch umgekehrt, ob die Chromatinorganisation die Funktion der Kernporen beeinflusst, insbesondere beim nukleozytoplasmatischen Transport. Der nukleozytoplasmatische Transport ist ein sehr schneller Prozess, daher besteht eine Herausforderung darin, Veränderungen in der Dynamik des nukleozytoplasmatischen Transports in lebenden Zellen zu erkennen.

Es gibt nicht viele Instrumente, um den nukleozytoplasmatischen Transport in lebenden Zellen zu überwachen. Durch die Implementierung einer halbautomatischen und verbesserten Technik hoffen wir, die Verwendung dieser Tools zu erleichtern. Unser Protokoll basiert auf Deep Learning.

Es begrenzt Fehler und reduziert den Zeitaufwand für die Analyse erheblich. Was früher einen Tag dauerte, dauert jetzt nur noch ein bis zwei Stunden. Starten Sie zunächst die FIJI-Software auf dem Computersystem.

Wählen Sie die stabile Phase als erstes Bild, die Beleuchtungsphase als zweites Bild und die Wiederherstellungsphase als drittes Bild aus. Verketten Sie die drei Bilder, die drei Phasen darstellen, um ein einzelnes Bild zu erzeugen. Speichern Sie das erhaltene, zusammengeführte Bild für die Segmentierung, indem Sie zu Datei navigieren und Als TIFF speichern auswählen.

Teilen Sie als Nächstes den mCherry-Kanal, indem Sie Bild-, Farb- und Geteilte Kanäle auswählen. Speichern Sie dann das geteilte Bild, indem Sie zu Datei, Speichern unter und TIFF gehen. Um zu überprüfen, ob es während der Aufnahme zu Bleichen gekommen ist, wählen Sie nacheinander Bild, Stapel und Z-Achsen-Profil plotten.

Klicken Sie dann auf Daten, gefolgt von Ersten Datensatz kopieren, und fügen Sie ihn in die bereitgestellte Tabelle unter der Profilzelle der Z-Achse ein. Zeichnen Sie nun einen kreisförmigen Interessenbereich, der sich der durchschnittlichen Größe eines Zellkerns annähert, indem Sie auf Analysieren, gefolgt von Tools und dann auf ROI-Manager klicken. Fügen Sie den ROI hinzu und speichern Sie ihn, indem Sie zu Mehr navigieren und auf Speichern klicken.

Platzieren Sie den gespeicherten ROI während des Zeitraffers in einem zellenfreien Bereich. Stellen Sie sicher, dass "Mittlerer Grauwert" unter "Analysieren und Messungen einstellen" ausgewählt ist. Klicken Sie dann auf Mehr, Multi Measure.

Aktivieren Sie "Alle 50 Slices messen" und "Ein ROI pro Slice" und klicken Sie auf OK, um die Intensität aufzuzeichnen. Kopieren Sie alle gemessenen Intensitätswerte und fügen Sie sie in die bereitgestellte Tabelle unter der Hintergrundzelle ROI ein. Schließen Sie dann das Bild nur mit dem mCherry-Kanal und wählen Sie das gespeicherte Bild mit den zusammengeführten Kanälen aus.

Öffnen Sie nun das TrackMate-Plugin, indem Sie nacheinander auf Plugins, Tracking und TrackMate klicken. Vergewissern Sie sich, dass die Zeitpunkte zwischen null und 49 liegen, und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie den StarDist-Detektor aus und klicken Sie auf Weiter.

Wählen Sie Kanal zwei, SiR-DNA, für die Kernsegmentierung und warten Sie, bis der Prozess abgeschlossen ist. Behalten Sie die Standardparameter im Fenster für den Schwellenwert bei, und klicken Sie auf Weiter. Erstellen Sie Filter mit der Option "Mittlere Intensität, Kanal Eins", um Kerne mit extremen Signalwerten auszuschließen.

Erstellen Sie einen Filter, um Werte oberhalb des definierten Schwellenwerts auszuwählen, und den anderen, um die Werte unterhalb des Schwellenwerts auszuwählen. Fügen Sie auf ähnliche Weise zwei Bereichsfilter hinzu, um Ablagerungen oder sterbende Zellen zu entfernen, und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie den Simple LAP-Tracker aus und klicken Sie auf Weiter.

Passen Sie als Nächstes die Tracking-Parameter an. Legen Sie den maximalen Verbindungsabstand auf 30 Mikrometer, den maximalen Abstand zum Lückenschluss auf 15 Mikrometer und den maximalen Rahmenabstand zum Lückenschluss auf drei Mikrometer fest. Klicken Sie dann auf Weiter.

Klicken Sie nach der Berechnung auf Weiter, um Filter für die Tracks festzulegen. Um nur Kerne auszuwählen, die während des gesamten Zeitverlaufs verfolgt wurden, wählen Sie die höchste Anzahl von Punkten in der Spur aus und klicken Sie auf Weiter. Aktivieren Sie dann "Anzeigepunktnamen", um jeden Kern in weiteren Analysen nachzuverfolgen und andere Anzeigemerkmale nach Belieben anzupassen.

Klicken Sie unten auf "Spuren" und wählen Sie "In CSV exportieren", um die Messtabelle zu speichern. Schließen Sie die Tabelle, und klicken Sie auf Weiter. Klicken Sie nun als Aktion auf "Capture Overlay" und drücken Sie dann auf Ausführen, gefolgt von OK, um ein Bild mit verfolgten Kernen zu erzeugen.

Speichern Sie das Bild, indem Sie nacheinander auf Datei, Speichern unter klicken und TIFF auswählen. Um die TrackMate CSV-Datei in die bereitgestellte Tabelle zu importieren, klicken Sie auf die Registerkarte Daten. Klicken Sie in der Gruppe "Transformationsdaten abrufen" auf "Aus Text/CSV" und klicken Sie auf "Importieren".

Kopieren Sie die Spalten Spot-IDB, Spur-IDC, Frame I und mittlere Intensität Kanal 1M und fügen Sie sie in die Spalten A bis D der bereitgestellten Tabelle ein. Sortieren Sie die Ergebnisse alphabetisch zuerst nach Spur-ID, Einzelkern, aus Zelle B5 und dann nach Frame, Zeitpunkt, aus Zelle C5. Öffnen Sie nun GraphPad Prism, erstellen Sie ein neues Blatt und kopieren Sie die Zeitspalte aus der Tabelle und fügen Sie sie ein. Fügen Sie dann die als relative Kernintensität erhaltenen Werte in die GraphPad-Prismentabelle ein.

Um das Diagramm der relativen Kernintensität zu erstellen, navigieren Sie zum Abschnitt Diagramm und wählen Sie XY als Diagrammfamilie aus. Wählen Sie dann "Punkte und Verbindungslinie mit Fehlerbalken" als Diagrammtyp aus. Wählen Sie in den Plot-Einstellungen "Mittelwert und Fehler" und "SEM" und klicken Sie auf OK. Um die Exportrate zu erhalten, klicken Sie anschließend auf Neue Datentabelle und geben Sie die Zeiten nur für Stabil- und Beleuchtungsphasen in Dezimalstellen ein.

Fügen Sie die Werte, die Sie als relative Kernintensität für diese Phasen erhalten haben, in die Tabelle ein. Klicken Sie im Abschnitt Ergebnisse auf XY-Analyse, gefolgt von Exponential. Wählen Sie dann Nichtlineare Regression und klicken Sie auf OK. Wählen Sie "Plateau gefolgt von einem Phasenzerfall" als Modell unter den Parametern aus.

Wählen Sie dann eine Konstante gleich 2,25 als X0, eine Konstante gleich eins als Y0 und eine Konstante gleich Null für das Plateau. Geben Sie an, dass K größer als Null sein soll, und drücken Sie OK. Erstellen Sie eine neue Tabelle, und fügen Sie die erhaltenen K-Werte ein. Wählen Sie im Abschnitt Diagramm die Option Spalte als Diagrammfamilie und dann das Violindiagramm als Diagrammtyp aus.

Wählen Sie "Alle Punkte anzeigen" als Diagramm aus, und klicken Sie auf OK. Der Kernexport mit der optogenetischen Sonde lexy wurde in der Lebendzellbildgebung sichtbar gemacht. In der Kontrollbedingung mit Methanol-behandelten Zellen nahm die nukleäre mCherry-Intensität nach Blaulichtbeleuchtung stark ab, gefolgt von einer allmählichen Erholung in der Phase nach der Beleuchtung. Die Behandlung mit dem Exporthemmer Leptomycin B führte zu einer Veränderung des Kernexports, da das Sondensignal über alle Zeitpunkte hinweg konsistent nuklear blieb.

Die quantitative Analyse der relativen Kernintensität zeigte im Laufe der Zeit eine langsame Abnahme bis zum Erreichen eines Plateaus am Ende der Beleuchtungsphase. Mittlere Leptomycin-B-Konzentrationen sollten einen milden Kernexport aufweisen. Die aus den Intensitätsdaten berechneten Exportraten bestätigten eine signifikant höhere Exportrate bei methanolbehandelten Zellen, eine viel niedrigere Rate bei 0,5 nanomolaren Leptomycin B und fast keine Exporte bei einem nanomolaren Leptomycin B.