Name: Verwendung von LEXY- und LINuS-Optogenetik-Tools und automatisierter Bildanalyse zur Quantifizierung der nukleozytoplasmatischen Transportdynamik in lebenden Zellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Lernen Sie die Anwendung von LEXY- und LINuS-Optogenetik-Tools zur Quantifizierung nukleozytoplasmatischer Transportdynamik in lebenden Zellen. Diese Methode ermöglicht präzise Einblicke in zelluläre Transportmechanismen.

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<ol><li>Wing, C. E., Fung, H. Y. J., Chook, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyopherin-mediated+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Karyopherin-mediated nucleocytoplasmic transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23, 307-328 (2022).</li>
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<li>Zayner, J. P., Antoniou, C., Sosnick, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+terminal+helix+modulates+light+activated+conformational+changes+in+AsLOV2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The amino terminal helix modulates light activated conformational changes in AsLOV2.</a> J Mol Biol. 419 (1-2), 61-74 (2012).</li>
<li>Wehler, P., Niopek, D., Eils, R., Di Ventura, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+nuclear+protein+import+in+living+cells+using+light-inducible+nuclear+localization+signals+%28LINuS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of nuclear protein import in living cells using light-inducible nuclear localization signals (LINuS).</a> Curr Protoc Chem Biol. 8 (2), 131-145 (2016).</li>
<li>Lataster, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+by+optogenetically+regulated+cell+cycle+inhibitor+protein+p21%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control by optogenetically regulated cell cycle inhibitor protein p21.</a> Biology. 12 (9), 1194(2023).</li>
<li>Forlani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+slow-cycling+variants+of+the+light-inducible+nuclear+protein+export+system+LEXY+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of slow-cycling variants of the light-inducible nuclear protein export system LEXY in mammalian cells.</a> ACS Synth Biol. 11 (10), 3529-3533 (2022).</li>
<li>Inutsuka, A., Kimizuka, N., Takanohashi, N., Yakabu, H., Onaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+a+blue+light+transmission+area+in+living+animals+using+light-induced+nuclear+translocation+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Visualization of a blue light transmission area in living animals using light-induced nuclear translocation of fluorescent proteins.</a> Biochem Biophys Res Commun. 522 (1), 138-143 (2020).</li>
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<li>Kudo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptomycin+B+inactivates+CRM1%2Fexportin+1+by+covalent+modification+at+a+cysteine+residue+in+the+central+conserved+region%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Leptomycin B inactivates CRM1/exportin 1 by covalent modification at a cysteine residue in the central conserved region.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (16), 9112-9117 (1999).</li>
<li>Soderholm, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importazole%2C+a+small+molecule+inhibitor+of+the+transport+receptor+importin-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Importazole, a small molecule inhibitor of the transport receptor importin-β.</a> ACS Chem Biol. 6 (7), 700-708 (2011).</li>
<li>Henderson, B. R., Eleftheriou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+activity%2C+sequence+specificity%2C+and+CRM1-dependence+of+different+nuclear+export+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A comparison of the activity, sequence specificity, and CRM1-dependence of different nuclear export signals.</a> Exp Cell Res. 256 (1), 213-224 (2000).</li>
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<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hitchhiking+of+Cas9+with+nucleus-localized+proteins+impairs+its+controllability+and+leads+to+efficient+genome+editing+of+NLS-free+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Hitchhiking of Cas9 with nucleus-localized proteins impairs its controllability and leads to efficient genome editing of NLS-free Cas9.</a> Mol Ther. 32 (4), 920-934 (2024).</li>
</ol>

Die Bedeutung des nukleozytoplasmatischen Transports (NCT) für die Regulierung wichtiger zellulärer Signalwege und die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase wurde in den letzten Jahren gut untersucht1. In der Folge wurden mehrere Werkzeuge entwickelt, um die Dynamik des NCT zu untersuchen 2,3,4. Zu diesen Instrumenten gehören die optogenetischen Sonden LINuS5 und LEXY6, die 2014 bzw. 2016 veröffentlicht wurden, eine leistungsstarke Möglichkeit, NCT in lebenden Zellen zu überwachen. Diese Werkzeuge, die so konzipiert sind, dass sie entweder den induzierbaren Export (LEXY) oder den Import (LINuS) eines fluoreszierenden Reporters verfolgen, sind durch Einwirkung von blauem Licht induzierbar und reversibel.
Kurz gesagt nutzen diese beiden kleinen Sonden die Eigenschaften der LOV2-Domäne aus dem Protein Phototropin-1 der Pflanze Avena sativa7. In Abwesenheit von blauem Licht wird die Jα-Helix aus der LOV2-Domäne photokäfigiert und in den Proteinkern eingebettet. Da die Jα-Helix auf Lichtreize reagieren kann, induziert die Beleuchtung durch blaues Licht eine Konformationsänderung und das anschließende Abkoppeln der Jα-Helix von der LOV2-Domäne. Die Autoren von LEXY und LINuS nutzten diese Lichtempfindlichkeit, um entweder ein nukleares Lokalisierungssignal (NLS) oder ein nukleares Exportsignal (NES) mit der Jα-Helix für LINuS bzw. LEXY zu fusionieren (Abbildung 1). Das resultierende Werkzeug ist eine Sonde, die bei Blaulichtbeleuchtung in den Zellkern (LINuS) oder das Zytosol (LEXY) transloziert.
Um die Sonden mit Fluoreszenzbildgebung zu verfolgen, wurde den Konstrukten auch ein mCherry-Fluoreszenzreporter hinzugefügt. Schließlich wurde dem System ein schwaches NES (für LINuS) oder NLS (für LEXY) hinzugefügt, um sicherzustellen, dass sich die Sonden nicht in ihrer endgültigen Lokalisation vor der Blaulichtbeleuchtung befanden, was die Beobachtung von LEXY- oder LINuS-Translokationen zwischen dem Zellkern und dem Zytosol verhindern würde.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig1.jpg"> 
Abbildung 1: Darstellung von LEXY- und LINuS-Sonden. Beide Sonden bestehen aus einem mCherry-Protein, das mit der lichtempfindlichen LOV2-Domäne fusioniert ist. Der Unterschied zwischen den beiden Werkzeugen liegt in der Signalsequenz, die von der Jα-Helix verdeckt wird: ein NES für LEXY und ein NLS für LINuS. Beide Sonden verfügen außerdem über eine schwache Signalsequenz, um ihre anfängliche Lokalisierung zu steuern: ein schwaches NLS für LEXY und ein schwaches NES für LINuS. Die Aktivierung der Systeme durch Blaulichtbeleuchtung bewirkt daher entweder ihren Export für LEXY oder ihren Import für LINuS, so dass die Benutzer den nuklearen Export oder Import überwachen können. Abkürzungen: LEXY = lichtinduzierbares nukleares Exportsystem; LINuS = lichtinduzierbares nukleares Lokalisierungssignal; NLS = nukleares Lokalisierungssignal; NES = nukleares Exportsignal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Die Lokalisierung der mCherry-Fluoreszenz zeigt das Shuttle von LEXY- und LINuS-Sonden zwischen Zellkernen und Zytosol und kann daher in der Lebendzellbildgebung verfolgt werden, was es dem Benutzer ermöglicht, NCT zu überwachen. LEXY und LINuS können nicht nur als einfache Sonden verwendet werden, sondern auch zur Kontrolle der Lokalisierung und zur Untersuchung von Proteinen von Interesse, in vitro 5,6,8,9 oder in vivo 10,11.
Die in den Publikationen LEXY und LINuS vorgeschlagene Quantifizierungsmethode zeigt die relative Kernintensität der Sonden. Die vorgeschlagene Analyse wird manuell durchgeführt und beruht auf der Messung einer Region of Interest (ROI) im Zellkern und im Zytosol. Obwohl diese Methode eine gute Darstellung des Signals der Sonde im Laufe der Zeit liefert, ist sie sehr langwierig und mühsam, insbesondere wenn Experimente und Bedingungen wiederholt werden. Wichtig ist, dass es dieser Methode auch an Genauigkeit mangelt, da nur ein kleiner Teil des entworfenen Fachs dargestellt wird.
Hier schlagen wir ein neues Protokoll für die Quantifizierung von LEXY- und LINuS-Fluoreszenzsignalen vor. Wir haben automatisierte Techniken implementiert, die die Analysen erleichtern und eine höhere Genauigkeit bieten. Dies erleichtert neuen Benutzern dieser Tools den Prozess und trägt dazu bei, den Durchsatz zu erhöhen. Unser Quantifizierungsprotokoll verwendet nur eine Schnittstelle, das Open-Source-Plugin TrackMate12 von FIJI. Um die Zuverlässigkeit der Quantifizierungen zu verbessern, haben wir einen Live-Imaging-kompatiblen dunkelroten DNA-Marker verwendet, um die Segmentierung des gesamten Zellkerns mit StarDist13, einem trainierten Convolutional Neural Network, durchzuführen, kombiniert mit der Verfolgung und Messung des Fluoreszenzsignals der Sonde mit TrackMate12.
Die erhaltenen Daten können dann einfach in die bereitgestellte und gebrauchsfertige Tabelle (Ergänzende Tabelle S1) exportiert werden, um die relative Kernintensität jedes identifizierten Kerns zu erhalten. Dieses Protokoll erklärt auch, wie man die erhaltenen Werte in einem Diagramm zusammenfasst, indem man die erhaltene Zeitverlaufskurve an ein monoexponentielles Modell anpasst, wie in Yoo und Mitchison14 , und wie man die Transportrate für die verschiedenen getesteten Bedingungen berechnet. Mit diesem Protokoll und der bereitgestellten Tabelle für die Analyse werden Benutzer in der Lage sein, Bildgebungsdaten von lebenden Zellen auch mit begrenzten Bioinformatikkenntnissen einfach zu quantifizieren.

<table><tbody><tr><td>Kollagen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>LEICA</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Ausstechen</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. F7524</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. F1141</td><td></td></tr><tr><td>Software für Fidschi</td><td>FIDSCHI</td><td></td><td>BildJ 2.16.0/1,54p; Java1.8.0_322</td></tr><tr><td>Fluoroschalen</td><td>Dutscher</td><td>Nr. FD3510-100</td><td>Alternativ: Attofluor-Kammer (Invitrogen #A7816)</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 10.4.1</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Importazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0341</td><td></td></tr><tr><td>Leptomycin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Nr. L2913</td><td></td></tr><tr><td>LEXY Plasmid</td><td>Addgene</td><td>72655</td><td>pDN122</td></tr><tr><td>LINuS-Plasmid</td><td>Addgene</td><td>61347</td><td>pDN77</td></tr><tr><td>Bleistift-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phenolrotfreies DMEM</td><td>Gibco</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>SiR-DNA</td><td>Spirochrom</td><td>Nr. SC007</td><td>Alternativ: SPY-DNA650 (Spirochrom #SC501)</td></tr><tr><td>Stardist 2D-Plugin</td><td>StarDist</td><td></td><td>StarDist_0.3.0</td></tr><tr><td>TrackMate-Plugin</td><td>TrackMate (Englisch)</td><td></td><td>TrackMate-7.14.0</td></tr></tbody></table>

verwendung von lexy- und linus-optogenetik-tools und automatisierter bildanalyse zur quantifizierung der nukleozytoplasmatischen transportdynamik in lebenden zellen

Using LEXY and LINuS Optogenetics Tools and Automated Image Analysis to Quantify Nucleocytoplasmic Transport Dynamics in Live Cells

Das oben erwähnte Protokoll sollte es den Anwendern ermöglichen, die Lokalisierung und Translokation der Sonde während der Aufnahme in der Lebendzellbildgebung zu visualisieren. Ein Beispiel für die erwarteten Bilder, die zur Visualisierung des Kernexports mit LEXY aufgenommen wurden, ist in Abbildung 4 dargestellt. Eine rasche Abnahme des Signals aus dem Zellkern und eine Anreicherung im Zytosol sollte nach einigen Runden blauer Lichtbeleuchtung beobachtet werden. Eine progressive Wiederherstellung des Signals der Sonde kann nach dem Stoppen der Beleuchtungszyklen sichtbar sein. Zur Steuerung des Systems bescheinigt Leptomycin B, ein Exporthemmer, dass eine Änderung des Exports mit den Analysen sichtbar gemacht werden kann, da es verhindert, dass LEXY bei Blaulichtbeleuchtung exportiert wird (Abbildung 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig4.jpg"> 
Abbildung 4: Visualisierung des LEXY-Signals über die Zeit. Erfassung repräsentativer Zeitpunkte der Stabil-, Beleuchtungs- und Erholungsphase, die mit Lebendzell-Imaging erfasst wurden. Die Methanolbedingung stellt die Kontrollbedingung dar. Bei pulsierender Beleuchtung mit blauem Licht in roter Farbe wird das mCherry-Fluoreszenzsignal, das den Standort von LEXY anzeigt, vom Zellkern in das Zytosol transloziert. Nach dem Stoppen der Beleuchtung wird das Signal im Zellkern wiederhergestellt. Die Behandlung mit dem Exportinhibitor Leptomycin B bei 1 nM oder 0,5 nM zeigt das Fehlen oder die Abnahme des LEXY-Exports, wenn der Export blockiert wird. Maßstabsleiste = 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Während die Werte der relativen Kernintensitätskurve während der stabilen Phase bei etwa 1 liegen sollten, sollten sie nach der Aktivierung von blauem Licht einen langsamen Abfall aufweisen, bis sie am Ende der Beleuchtungsphase ein Plateau erreichen (Abbildung 5A). Ist der Abfall zu schnell oder zu langsam, können die Erfassungsparameter optimiert werden (siehe Diskussion). Die Behandlung mit Leptomycin B in ausreichenden Konzentrationen kann auch bestätigen, dass die Analysen und die Technik empfindlich genug sind, um zu zeigen, dass der Kernexport vollständig blockiert ist, wobei die relativen Kernintensitätswerte während des gesamten Experiments stabil bei etwa 1 liegen. Mittlere Leptomycin-B-Konzentrationen sollten jedoch einen milden nuklearen Export aufweisen (Abbildung 5A). Diese visuellen Beobachtungen sollten quantitativ durch die Ermittlung der Ausfuhrquote bestätigt werden (Abbildung 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68585/68585fig5.jpg"> 
Abbildung 5: Erwartete relative Kernintensität von LEXY und Transportrate. (A) Die Grafik zeigt die relative Kernintensität des Fluoreszenzsignals von LEXY über die Zeit, normiert auf die mittlere mCherry-Intensität der stabilen Phase. Die relative Kernintensität des Methanolzustands (Kontrolle, rot) nimmt nach der Beleuchtung um die Hälfte ab, im Gegensatz zu den mit dem Exportinhibitor Leptomycin B behandelten Zellen bei einer Konzentration von 0,5 nM (hellblau) bzw. 1 nM (dunkelblau). Fehlerbalken: SEM. (B) Exportrate der Kontroll- und Leptomycin-B-Bedingungen, erhalten durch Anpassung der Kurve an ein monoexponentielles Modell. Die Werte, die erhalten werden, wenn die Ausfuhr durch Leptomycin B blockiert wird, sind signifikant niedriger als die Kontrollbedingung. N = 18 Zellen für Methanol (rot), 19 Zellen für Leptomycin B 0,5 nM (hellblau) und 15 Zellen für Leptomycin B 1 nM (dunkelblau). Die P-Werte wurden durch einen zweiseitigen Welch-t-Test berechnet. : P &lt; 1×10−4, ****: P &lt; 1×10−5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/68585fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Tabelle S1: Tabelle mit vordefinierten Berechnungen. Diese Tabelle wird zur Verfügung gestellt, um die Analyse zu erleichtern. Die mit TrackMate erhaltenen Intensitätswerte können direkt kopiert und in die Tabelle eingefügt werden, um die normalisierten relativen Kernintensitätswerte zu erhalten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/JOVE-Supplemental_Table1.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle S2: Beispiel für die erwarteten Ergebnisse für eine Kontrollbedingung der LEXY-Analyse. Die Tabelle stellt ein Beispiel für die erhaltenen Werte für eine Kontrollbedingung der stabilen Zelllinie von LEXY dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68585/JOVE-Supplemental_Table2.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Verwendung von LEXY- und LINuS-Optogenetik-Tools und automatisierter Bildanalyse zur Quantifizierung der nukleozytoplasmatischen Transportdynamik in lebenden Zellen

Nucleocytoplasmic transport (NCT) is essential for maintaining cellular homeostasis, and its disruption is involved in various diseases, including ...

Unser Labor untersucht das Zusammenspiel zwischen den Kernporen und der Chromatinorganisation. Wir untersuchen also, wie die Kernporen die Chromatinorganisation beeinflussen, aber auch umgekehrt, ob die Chromatinorganisation die Funktion der Kernporen beeinflusst, insbesondere beim nukleozytoplasmatischen Transport. Der nukleozytoplasmatische Transport ist ein sehr schneller Prozess, daher besteht eine Herausforderung darin, Veränderungen in der Dynamik des nukleozytoplasmatischen Transports in lebenden Zellen zu erkennen.Es gibt nicht viele Instrumente, um den nukleozytoplasmatischen Transport in lebenden Zellen zu überwachen. Durch die Implementierung einer halbautomatischen und verbesserten Technik hoffen wir, die Verwendung dieser Tools zu erleichtern. Unser Protokoll basiert auf Deep Learning.Es begrenzt Fehler und reduziert den Zeitaufwand für die Analyse erheblich. Was früher einen Tag dauerte, dauert jetzt nur noch ein bis zwei Stunden. Starten Sie zunächst die FIJI-Software auf dem Computersystem.Wählen Sie die stabile Phase als erstes Bild, die Beleuchtungsphase als zweites Bild und die Wiederherstellungsphase als drittes Bild aus. Verketten Sie die drei Bilder, die drei Phasen darstellen, um ein einzelnes Bild zu erzeugen. Speichern Sie das erhaltene, zusammengeführte Bild für die Segmentierung, indem Sie zu Datei navigieren und Als TIFF speichern auswählen.Teilen Sie als Nächstes den mCherry-Kanal, indem Sie Bild-, Farb- und Geteilte Kanäle auswählen. Speichern Sie dann das geteilte Bild, indem Sie zu Datei, Speichern unter und TIFF gehen. Um zu überprüfen, ob es während der Aufnahme zu Bleichen gekommen ist, wählen Sie nacheinander Bild, Stapel und Z-Achsen-Profil plotten.Klicken Sie dann auf Daten, gefolgt von Ersten Datensatz kopieren, und fügen Sie ihn in die bereitgestellte Tabelle unter der Profilzelle der Z-Achse ein. Zeichnen Sie nun einen kreisförmigen Interessenbereich, der sich der durchschnittlichen Größe eines Zellkerns annähert, indem Sie auf Analysieren, gefolgt von Tools und dann auf ROI-Manager klicken. Fügen Sie den ROI hinzu und speichern Sie ihn, indem Sie zu Mehr navigieren und auf Speichern klicken.Platzieren Sie den gespeicherten ROI während des Zeitraffers in einem zellenfreien Bereich. Stellen Sie sicher, dass "Mittlerer Grauwert" unter "Analysieren und Messungen einstellen" ausgewählt ist. Klicken Sie dann auf Mehr, Multi Measure.Aktivieren Sie "Alle 50 Slices messen" und "Ein ROI pro Slice" und klicken Sie auf OK, um die Intensität aufzuzeichnen. Kopieren Sie alle gemessenen Intensitätswerte und fügen Sie sie in die bereitgestellte Tabelle unter der Hintergrundzelle ROI ein. Schließen Sie dann das Bild nur mit dem mCherry-Kanal und wählen Sie das gespeicherte Bild mit den zusammengeführten Kanälen aus.Öffnen Sie nun das TrackMate-Plugin, indem Sie nacheinander auf Plugins, Tracking und TrackMate klicken. Vergewissern Sie sich, dass die Zeitpunkte zwischen null und 49 liegen, und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie den StarDist-Detektor aus und klicken Sie auf Weiter.Wählen Sie Kanal zwei, SiR-DNA, für die Kernsegmentierung und warten Sie, bis der Prozess abgeschlossen ist. Behalten Sie die Standardparameter im Fenster für den Schwellenwert bei, und klicken Sie auf Weiter. Erstellen Sie Filter mit der Option "Mittlere Intensität, Kanal Eins", um Kerne mit extremen Signalwerten auszuschließen.Erstellen Sie einen Filter, um Werte oberhalb des definierten Schwellenwerts auszuwählen, und den anderen, um die Werte unterhalb des Schwellenwerts auszuwählen. Fügen Sie auf ähnliche Weise zwei Bereichsfilter hinzu, um Ablagerungen oder sterbende Zellen zu entfernen, und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie den Simple LAP-Tracker aus und klicken Sie auf Weiter.Passen Sie als Nächstes die Tracking-Parameter an. Legen Sie den maximalen Verbindungsabstand auf 30 Mikrometer, den maximalen Abstand zum Lückenschluss auf 15 Mikrometer und den maximalen Rahmenabstand zum Lückenschluss auf drei Mikrometer fest. Klicken Sie dann auf Weiter.Klicken Sie nach der Berechnung auf Weiter, um Filter für die Tracks festzulegen. Um nur Kerne auszuwählen, die während des gesamten Zeitverlaufs verfolgt wurden, wählen Sie die höchste Anzahl von Punkten in der Spur aus und klicken Sie auf Weiter. Aktivieren Sie dann "Anzeigepunktnamen", um jeden Kern in weiteren Analysen nachzuverfolgen und andere Anzeigemerkmale nach Belieben anzupassen.Klicken Sie unten auf "Spuren" und wählen Sie "In CSV exportieren", um die Messtabelle zu speichern. Schließen Sie die Tabelle, und klicken Sie auf Weiter. Klicken Sie nun als Aktion auf "Capture Overlay" und drücken Sie dann auf Ausführen, gefolgt von OK, um ein Bild mit verfolgten Kernen zu erzeugen.Speichern Sie das Bild, indem Sie nacheinander auf Datei, Speichern unter klicken und TIFF auswählen. Um die TrackMate CSV-Datei in die bereitgestellte Tabelle zu importieren, klicken Sie auf die Registerkarte Daten. Klicken Sie in der Gruppe "Transformationsdaten abrufen" auf "Aus Text/CSV" und klicken Sie auf "Importieren".Kopieren Sie die Spalten Spot-IDB, Spur-IDC, Frame I und mittlere Intensität Kanal 1M und fügen Sie sie in die Spalten A bis D der bereitgestellten Tabelle ein. Sortieren Sie die Ergebnisse alphabetisch zuerst nach Spur-ID, Einzelkern, aus Zelle B5 und dann nach Frame, Zeitpunkt, aus Zelle C5. Öffnen Sie nun GraphPad Prism, erstellen Sie ein neues Blatt und kopieren Sie die Zeitspalte aus der Tabelle und fügen Sie sie ein. Fügen Sie dann die als relative Kernintensität erhaltenen Werte in die GraphPad-Prismentabelle ein.Um das Diagramm der relativen Kernintensität zu erstellen, navigieren Sie zum Abschnitt Diagramm und wählen Sie XY als Diagrammfamilie aus. Wählen Sie dann "Punkte und Verbindungslinie mit Fehlerbalken" als Diagrammtyp aus. Wählen Sie in den Plot-Einstellungen "Mittelwert und Fehler" und "SEM" und klicken Sie auf OK. Um die Exportrate zu erhalten, klicken Sie anschließend auf Neue Datentabelle und geben Sie die Zeiten nur für Stabil- und Beleuchtungsphasen in Dezimalstellen ein.Fügen Sie die Werte, die Sie als relative Kernintensität für diese Phasen erhalten haben, in die Tabelle ein. Klicken Sie im Abschnitt Ergebnisse auf XY-Analyse, gefolgt von Exponential. Wählen Sie dann Nichtlineare Regression und klicken Sie auf OK. Wählen Sie "Plateau gefolgt von einem Phasenzerfall" als Modell unter den Parametern aus.Wählen Sie dann eine Konstante gleich 2,25 als X0, eine Konstante gleich eins als Y0 und eine Konstante gleich Null für das Plateau. Geben Sie an, dass K größer als Null sein soll, und drücken Sie OK. Erstellen Sie eine neue Tabelle, und fügen Sie die erhaltenen K-Werte ein. Wählen Sie im Abschnitt Diagramm die Option Spalte als Diagrammfamilie und dann das Violindiagramm als Diagrammtyp aus.Wählen Sie "Alle Punkte anzeigen" als Diagramm aus, und klicken Sie auf OK. Der Kernexport mit der optogenetischen Sonde lexy wurde in der Lebendzellbildgebung sichtbar gemacht. In der Kontrollbedingung mit Methanol-behandelten Zellen nahm die nukleäre mCherry-Intensität nach Blaulichtbeleuchtung stark ab, gefolgt von einer allmählichen Erholung in der Phase nach der Beleuchtung. Die Behandlung mit dem Exporthemmer Leptomycin B führte zu einer Veränderung des Kernexports, da das Sondensignal über alle Zeitpunkte hinweg konsistent nuklear blieb.Die quantitative Analyse der relativen Kernintensität zeigte im Laufe der Zeit eine langsame Abnahme bis zum Erreichen eines Plateaus am Ende der Beleuchtungsphase. Mittlere Leptomycin-B-Konzentrationen sollten einen milden Kernexport aufweisen. Die aus den Intensitätsdaten berechneten Exportraten bestätigten eine signifikant höhere Exportrate bei methanolbehandelten Zellen, eine viel niedrigere Rate bei 0,5 nanomolaren Leptomycin B und fast keine Exporte bei einem nanomolaren Leptomycin B.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Einzel-Molekül-Mikroskopie approch neue Einblicke in atomare Transport.

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

Intrazellulärer Transport von Frachten, wie Vesikeln oder Organellen, wird von molekularen Motorproteinen durchgeführt, die auf polarisierten Mikrotubuli verfolgen. Dieses Protokoll beschreibt die Korrelation der Transportrichtung einzelner Frachtpartikel, die sich innerhalb von Neuronen bewegen, mit der relativen Menge und Art der assoziierten Motorproteine.

Charakterisierung der Zusammensetzung der molekulare Motoren auf Umzug Axonal Fracht Mit &quot;Fracht Mapping&quot; Analysis

Lichtmikroskopische Techniken in Verbindung mit biochemischen Assays klären die Beteiligung der SNARE-vermittelten Exozytose an der Netrin-abhängigen Axonverzweigung auf. Diese Kombination von Techniken ermöglicht die Identifizierung molekularer Mechanismen, die die Axonverzweigung und die Veränderung der Zellform steuern.

Kombinierte Methodiken Verwendung der Rolle der Plasmamembran Lieferung Während Axon Branching und Neuronale Morphogenese zu definieren

Die Untersuchung des Membranhandels ist entscheidend für das Verständnis der neuronalen Funktionen. Hier stellen wir eine Methode zur Quantifizierung der Vesikelmotilität in Neuronen vor. Dies ist eine bequeme Methode, die an die Quantifizierung des Membranhandels im Nervensystem angepasst werden kann.

Quantifizierung von Endosom- und Lysosom-Motilen in kultivierten Neuronen mit fluoreszierenden Sonden

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur sensitiven Messung der nukleozytoplasmatischen Transportrate in motorischen neuronähnlichen NSC-34-Zellen durch Quantifizierung der Echtzeitveränderung des nuklearen Importes eines NLS-NES-GFP-Proteins.

Assay zur Messung des nukleozytoplasmatischen Transports in Echtzeit in motorischen Neuronen-ähnlichen NSC-34-Zellen

Caenorhabditis elegans (C. Elegans) ist ein gutes Modell, axonalen und intrazellulären Transport zu studieren. Hier beschreibe ich ein Protokoll zur in-Vivo -Erfassung und Analyse der axonalen und intraflagellar Transport in C. Elegans.

Immobilisierung von Caenorhabditis Elegans analysieren intrazellulären Transport in Neuronen

Hier beschreiben wir eine In-vitro-Live-Imaging-Methode zur Visualisierung des intrazellulären Transports von Organellen und des Handels mit Plasmamembranproteinen in murinen Astrozyten. Dieses Protokoll stellt auch eine Bildanalysemethodik zur Bestimmung von Frachttransportrouten und Kinetik dar.

Visualisierung und Analyse des intrazellulären Transports von Organellen und anderen Ladungen in Astrozyten

Ein Protokoll zur Abbildung der dynamischen Mikrotubuli in vivo unter Verwendung fluoreszierend markierten Endbindungsproteins wurde vorgestellt. Wir beschrieben die Methoden zur Markierung, Abbildung und Analyse der dynamischen Mikrotubuli im neuron posterioren lateralen Mikrotubuli (PLM) von C. elegans.

Im lebenden Organismus Beurteilung der Dynamik und Orientierung von Mikrotubuli in Caenorhabditis elegans Neuronen

Hier zeigen wir, wie die Transfektion von primären hippokampalen Nagetierneuronen mit konfokaler Bildgebung in lebenden Zellen kombiniert werden kann, um pathologische Protein-induzierte Effekte auf den axonalen Transport zu analysieren und mechanistische Signalwege zu identifizieren, die diese Effekte vermitteln.

Verwendung von Lebendzell-Imaging zur Messung der Auswirkungen pathologischer Proteine auf den axonalen Transport in primären Hippocampus-Neuronen

Die Arbeit beschreibt die Optimierung von Fluoreszenzmikroskopie-Erfassungsparametern, um den axonalen Transport von endogenen markierten Frachten mit Einzelneuronenauflösung in einem lebenden Fadenwurm sichtbar zu machen.

Optimierung der Visualisierung des axonalen Transports endogener Fracht durch Fluoreszenzmikroskopie bei lebenden Caenorhabditis elegans

Lernen Sie die Anwendung von LEXY- und LINuS-Optogenetik-Tools zur Quantifizierung nukleozytoplasmatischer Transportdynamik in lebenden Zellen. Diese Methode ermöglicht präzise Einblicke in zelluläre Transportmechanismen.

Verwendung von LEXY- und LINuS-Optogenetik-Tools und automatisierter Bildanalyse zur Quantifizierung der nukleozytoplasmatischen Transportdynamik in lebenden Zellen (Video) | JoVE Journal

Verwendung von LEXY- und LINuS-Optogenetik-Tools und automatisierter Bildanalyse zur Quantifizierung der nukleozytoplasmatischen Transportdynamik in lebenden Zellen

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